本文關(guān)鍵詞：柯薩奇病毒感染小鼠心肌細(xì)胞及心臟成纖維細(xì)胞后CD80與CD86的表達(dá)情況

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【摘要】：目的:病毒性心肌炎(Viral myocarditis,VMC)是指由病毒感染引起的心肌疾病,其中最常見的原因是由柯薩奇病毒B3(Coxsackie virus B3,CVB3)感染。病毒感染以后引起心肌炎的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,目前較多的研究認(rèn)為是病毒直接損傷和感染后機(jī)體的免疫反應(yīng)引發(fā)的炎癥性損傷。病毒性心肌炎可發(fā)展為擴(kuò)張性心肌病,兒童發(fā)病后致死致殘率較高,且到目前為止臨床仍然缺乏特效的治療方法。因此對于CVB3感染以后引起病毒性心肌炎的發(fā)病過程以及治療方法的研究都非常有必要。心臟中除了最有功能的心肌細(xì)胞以外,還有50%的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。所以對心臟心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞在CVB3刺激以后產(chǎn)生的反應(yīng)進(jìn)行研究,可以為研究病毒性心肌炎的發(fā)病過程及找到有效的治療方法提供一定的依據(jù)。方法:1體外培養(yǎng)C57BL/6小鼠心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞:無菌操作取新生C57BL/6小鼠心臟,取出后,放入不含有血清和抗生素的DMEM高糖培養(yǎng)基中。先除心臟以外的組織,再使用吸管反復(fù)吹打進(jìn)行沖洗,沖洗完的心臟中重新加入少量不含血清和雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基。用無菌剪刀將其剪碎,依次用胰酶與Ⅱ型膠原酶消化后,用銅網(wǎng)過濾。將濾液收集到離心管中進(jìn)行離心。去掉上清液后再離心一次,再次棄去上清液,加入含有血清和雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基。吹散后將細(xì)胞鋪入六孔板內(nèi)。90分鐘后,把孔內(nèi)未貼壁的細(xì)胞吸出移至新的六孔板中,向剩余孔內(nèi)再加入新鮮的含血清DMEM高糖培養(yǎng)基(采用1.5小時差速貼壁法分離培養(yǎng)小鼠心肌細(xì)胞與心臟成纖維細(xì)胞)。最后將六孔板放入CO_2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃進(jìn)行培養(yǎng)。2培養(yǎng)經(jīng)柯薩奇病毒感染后的小鼠心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞并且觀察細(xì)胞病變。3細(xì)胞CD80和CD86的表達(dá)情況測定:Trizol法提取細(xì)胞總RNA,按照試劑說明提取感染柯薩奇病毒后不同時間點的心肌細(xì)胞總RNA和心臟成纖維細(xì)胞總RNA。本實驗中心肌細(xì)胞感染柯薩奇病毒后選擇的時間點分別為1天、3天、5天、7天、9天;心臟成纖維細(xì)胞感染柯薩奇病毒后選擇的時間點分別為3小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時。未感染病毒的正常細(xì)胞作為對照組,進(jìn)行Real Time PCR擴(kuò)增,觀察細(xì)胞CD80和CD86的表達(dá)情況。結(jié)果:1小鼠心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞能夠進(jìn)行體外培養(yǎng)并且生長狀況良好。2觀察柯薩奇病毒感染后的細(xì)胞發(fā)現(xiàn):小鼠心肌細(xì)胞中部分細(xì)胞出現(xiàn)了病變,而小鼠心臟成纖維細(xì)胞中只有少量細(xì)胞出現(xiàn)了病變。3進(jìn)行Real Time PCR后,結(jié)果顯示:感染柯薩奇病毒以后,心肌細(xì)胞中CD80的mRNA的表達(dá)在第1天驟然下降,而后開始升高,在第3天達(dá)到高峰,接著又開始下降,第5天、第7天、第9天持續(xù)下降,整個過程均在正常水平以下;CD86的mRNA的表達(dá)同樣在第1天明顯下降,而后開始升高,在第3天達(dá)到高峰,接著開始下降,第5天、第7天、第9天持續(xù)下降,整個過程均在正常水平以下。Real Time PCR的結(jié)果也顯示,在被柯薩奇病毒感染以后,心臟成纖維細(xì)胞中CD80的mRNA的表達(dá)在3小時、6小時、12小時、24小時持續(xù)下降,24小時降至最低點,接著開始上升,48小時、72小時持續(xù)上升,整個過程均在正常水平以下;CD86的mRNA的表達(dá)在3小時、6小時持續(xù)下降,6小時降至最低點,但在12小時突然升高,超過正常水平,達(dá)到最高峰,接著24小時又下降,但在48小時又升高,達(dá)到第二個高峰,第二個高峰在正常水平以下,在72小時又下降。結(jié)果表明CD80和CD86的低表達(dá)可能是造成成年人早期感染CVB3以后,免疫損傷較輕而病毒直接損傷較重的原因。結(jié)論:1 CVB3感染以后,早期病毒主要對部分小鼠的心肌細(xì)胞進(jìn)行破壞,而并未明顯損傷心臟成纖維細(xì)胞,小鼠心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)時均有增殖。2 正常小鼠的心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞中均表達(dá)CD80與CD86mRNA。3 在小鼠心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞被CVB3感染以后,細(xì)胞內(nèi)的CD80與CD86mRNA的表達(dá)均會出現(xiàn)波動性的變化,且均有明顯的表達(dá)降低。由此我們可以認(rèn)為感染早期低表達(dá)的CD80和CD86可與細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)結(jié)合,負(fù)性調(diào)節(jié),抑制T細(xì)胞的增殖,使T細(xì)胞無法發(fā)揮細(xì)胞免疫的作用而致使病情繼續(xù)發(fā)展。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R542.21

【參考文獻(xiàn)】

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1 孫景輝;翟淑波;;病毒性心肌炎發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J];臨床兒科雜志;2012年07期

2 莊建新,馬沛然,王玉林,李秋波,徐海燕,于永慧;靜脈滴注人血免疫球蛋白對病毒性心肌炎心肌細(xì)胞凋亡與壞死的影響[J];實用兒科臨床雜志;2005年03期

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本文編號：1191957