本文關(guān)鍵詞：miR-206靶向ZFP580調(diào)控平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換研究

  更多相關(guān)文章： 轉(zhuǎn)化型生長因子-β ZFP580 microRNA-206 SMa-actin SM22a 血管平滑肌細(xì)胞 分化 Smad2/3

【摘要】：目的:調(diào)控血管平滑肌(VSMC)表型轉(zhuǎn)換是防治PCI術(shù)后再狹窄的新策略,micro RNA作為VSMC表型轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)因子,可通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控下游靶基因的的表達(dá)從而影響VSMC的表型轉(zhuǎn)換。本組首先克隆的C2H2型鋅指核轉(zhuǎn)錄因子ZFP580可調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞及VSMC的增殖及遷移而影響血管重塑。本組新近實驗證明:micro RNA-206既可靶向調(diào)控ZFP580的表達(dá),又可促進(jìn)VSMC從收縮型向合成型轉(zhuǎn)換。本實驗擬采用micro RNA-up與micro RNA-down技術(shù),觀察micro RNA-206表達(dá)水平的變化對大鼠VSMC分化功能的影響,并驗證其可能的分子機(jī)制。方法:提取分離大鼠VSMC,通過形態(tài)學(xué)觀察及免疫組化法進(jìn)行鑒定。生物信息學(xué)分析ZFP580與mi R-206的結(jié)合位點(diǎn)。利用TGF-β(根據(jù)文獻(xiàn)參考選取2ng/ml)對大鼠VSMC進(jìn)行不同時間點(diǎn)刺激,對照組選用等量的DMEM。Realtime-PCR測定mi R-206的表達(dá)水平;Western-blot檢測ZFP580、SMa-actin、SM22a、Smad2/3、phospho-Smad2/3的表達(dá)水平;使用慢病毒過表達(dá)或低表達(dá)mi R-206、慢病毒過表達(dá)或低表達(dá)ZFP580和應(yīng)用SB431542抑制劑后檢測相關(guān)指標(biāo);熒光素酶報告實驗(Luciferase)檢測mi R-206與ZFP580 3‘UTR的結(jié)合作用。結(jié)果:(1)在大鼠VSMC加入適宜的TGF-β(根據(jù)文獻(xiàn)參考選取2ng/ml)進(jìn)行預(yù)處理,分別刺激大鼠VSMC 6h、12h、24h、48h,對照組中加入等量的DMEM。利用Realtime-PCR測定mi R-206的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在12h的時候mi R-206的水平降至最低點(diǎn),與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。Western-blot檢測ZFP580的表達(dá)水平,結(jié)果顯示同樣在12h時ZFP580的表達(dá)水平達(dá)到最高,與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。故在隨后的實驗當(dāng)中,時間節(jié)點(diǎn)選取12h作為實驗刺激最佳時間點(diǎn)。(2)SMa-actin、SM22a、Smad2/3、phospho-Smad2/3的表達(dá)水平:利用TGF-β(2ng/ml)刺激VSMC不同時間點(diǎn)均導(dǎo)致phospho-Smad2/3的升高,隨著刺激時間的延長呈現(xiàn)著表達(dá)減少的趨勢。而Smad2/3的表達(dá)各組間無明顯差異。TGF-β可誘導(dǎo)大鼠VSMC由合成表型向收縮表型的轉(zhuǎn)換,促進(jìn)VSMC的分化,在實驗當(dāng)中隨著TGF-β的刺激,平滑肌細(xì)胞的分化標(biāo)記物SMa-actin、SM22a與對照組相比表達(dá)顯著上調(diào)(P0.05)。(3)SB431542減少TGF-β(2ng/ml)刺激導(dǎo)致的ZFP580、SMa-actin、SM22a表達(dá)水平的升高:選取20μM的SB431542對VSMC進(jìn)行預(yù)處理,2h后加入TGF-β(2ng/ml)刺激VSMC12h,對照組加入等量DMSO預(yù)處理細(xì)胞余處理相同,以空白對照組為參照。從結(jié)果當(dāng)中發(fā)現(xiàn),在預(yù)先加入SB431542之后明顯降低了TGF-β(2ng/ml)誘導(dǎo)ZFP580的表達(dá)上調(diào)(P0.05),phospho-Smad2/3的表達(dá)水平較對照組明顯降低(P0.05)。與此同時,Western-blot檢測SMa-actin、SM22a的表達(dá)水平結(jié)果顯示:SMa-actin、SM22a的表達(dá)較對照組相比均不同程度的降低(P0.05)。(4)SB431542減少TGF-β(2ng/ml)刺激導(dǎo)致的mi R-206水平的下調(diào):選取20μM的SB431542對VSMC進(jìn)行預(yù)處理,2h后加入TGF-β(2ng/ml)刺激VSMC12h,隨后利用Realtime-PCR測定mi R-206的表達(dá)水平,結(jié)果顯示mi R-206的表達(dá)水平較對照組上調(diào)了大約2.5倍(P0.05)。(5)慢病毒過表達(dá)mi R-206:攜帶mi R-206基因慢病毒載體按10 MOI感染大鼠VSMC 72小時后,在倒置熒光顯微鏡488nm激發(fā)光下觀察綠色熒光產(chǎn)生情況,細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到80%以上,Realtime-PCR檢測VSMC中mi R-206的基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示Lv-GFP組與對照組相比沒有明顯差異(P0.05),Lv-rno-mi R-206轉(zhuǎn)染組與對照組組相比,mi R-206的基因表達(dá)水平顯著增高(P0.05)。在慢病毒轉(zhuǎn)染后,加入TGF-β(2ng/ml)刺激VSMC12h,對照組選取正常的VSMC加入等量的TGF-β(2ng/ml)。在隨后的結(jié)果中發(fā)現(xiàn):Western-blot檢測SMa-actin、SM22a的表達(dá)水平對比對照組顯著降低(P0.05)。而mi R-206的基因表達(dá)水平較對照組降低(P0.05)。(6)過表達(dá)或低表達(dá)mi R-206慢病毒感染大鼠VSMC72h后,。Western-blot檢測ZFP580的表達(dá)水平,結(jié)果顯示:Lv-rno-mi R-206感染組與對照組相比,ZFP580的表達(dá)水平下調(diào)(P0.05),mi R-206低表達(dá)感染組與對照組相比,ZFP580的表達(dá)水平顯著上升(P0.05)。(7)過表達(dá)或低表達(dá)ZFP580慢病毒感染大鼠VSMC72h后。Western-blot檢測ZFP580的表達(dá)水平,結(jié)果顯示:高表達(dá)ZFP580感染組與對照組相比,SMa-actin與SM22a的表達(dá)水平上調(diào)(P0.05),低表達(dá)ZFP580感染組與對照組相比,SMa-actin、SM22a的表達(dá)水平顯著上升(P0.05)。(8)熒光素酶報告實驗(Luciferase)對mi R-206與ZFP580進(jìn)行外源性驗證:克隆ZFP580的3'UTR區(qū)域,構(gòu)建到熒光素酶報告基因載體p GL-3M中。293細(xì)胞轉(zhuǎn)染mi R-206過表達(dá)及對照病毒,隨后將報告基因載體和內(nèi)參質(zhì)粒p RL-CMV在脂質(zhì)體lipofectin 2000介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)染mi R-206過表達(dá)的293細(xì)胞。48h后,檢測Luciferase活性,結(jié)果顯示:mi R-206過表達(dá)組p GL-3M的報告活性顯著降低,提示mi R-206可與ZFP580的3'UTR區(qū)域結(jié)合。結(jié)論:TGF-β可以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞由合成型向收縮型轉(zhuǎn)換,并且上調(diào)VSMC分化標(biāo)記物SMa-actin、SM22a的表達(dá)水平,TGF-β通過經(jīng)典的Smad2/3通路調(diào)控micro RNA-206與ZFP580的表達(dá),過表達(dá)mi R-206可以造成SMa-actin、SM22a及ZFP580的表達(dá)降低,抑制平滑肌細(xì)胞的分化。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R541.4

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 韓勁草,劉喜林,顧海波,陳松林,李宜富;同強(qiáng)度不同波長β射線培養(yǎng)液對兔血管平滑肌細(xì)胞生長的影響[J];中國醫(yī)藥導(dǎo)刊;2004年01期

2 徐正云,任國珍,馬愛群;干細(xì)胞分化為平滑肌細(xì)胞參與血管病變[J];中國心血管雜志;2005年03期

3 武曉靜,黃嵐,趙剛,晉軍,張波,宋明寶,蔣世忠;內(nèi)皮細(xì)胞表型改變對平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換及遷移的作用[J];高血壓雜志;2003年05期

4 王春;許燦新;郭紫芬;李君牧;羅迪賢;廖端芳;李凱;;無或低血清條件下高壓培養(yǎng)促進(jìn)平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞生長[J];中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志;2011年02期

5 洪方耀;;平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)在動脈粥樣硬化研究中的應(yīng)用[J];河北醫(yī)藥;1984年05期

6 劉貴生,卞紅磊,武惠珍,李淑榮,雷建章;消化道平滑肌細(xì)胞間的機(jī)械連接和通訊連接[J];電子顯微學(xué)報;2002年05期

7 鄧R，

本文編號：1180603