本文關鍵詞：miR-206靶向ZFP580調(diào)控平滑肌細胞表型轉換研究

  更多相關文章： 轉化型生長因子-β ZFP580 microRNA-206 SMa-actin SM22a 血管平滑肌細胞 分化 Smad2/3

【摘要】：目的:調(diào)控血管平滑肌(VSMC)表型轉換是防治PCI術后再狹窄的新策略,micro RNA作為VSMC表型轉換的調(diào)節(jié)因子,可通過轉錄后水平調(diào)控下游靶基因的的表達從而影響VSMC的表型轉換。本組首先克隆的C2H2型鋅指核轉錄因子ZFP580可調(diào)控內(nèi)皮細胞及VSMC的增殖及遷移而影響血管重塑。本組新近實驗證明:micro RNA-206既可靶向調(diào)控ZFP580的表達,又可促進VSMC從收縮型向合成型轉換。本實驗擬采用micro RNA-up與micro RNA-down技術,觀察micro RNA-206表達水平的變化對大鼠VSMC分化功能的影響,并驗證其可能的分子機制。方法:提取分離大鼠VSMC,通過形態(tài)學觀察及免疫組化法進行鑒定。生物信息學分析ZFP580與mi R-206的結合位點。利用TGF-β(根據(jù)文獻參考選取2ng/ml)對大鼠VSMC進行不同時間點刺激,對照組選用等量的DMEM。Realtime-PCR測定mi R-206的表達水平;Western-blot檢測ZFP580、SMa-actin、SM22a、Smad2/3、phospho-Smad2/3的表達水平;使用慢病毒過表達或低表達mi R-206、慢病毒過表達或低表達ZFP580和應用SB431542抑制劑后檢測相關指標;熒光素酶報告實驗(Luciferase)檢測mi R-206與ZFP580 3‘UTR的結合作用。結果:(1)在大鼠VSMC加入適宜的TGF-β(根據(jù)文獻參考選取2ng/ml)進行預處理,分別刺激大鼠VSMC 6h、12h、24h、48h,對照組中加入等量的DMEM。利用Realtime-PCR測定mi R-206的表達水平,結果發(fā)現(xiàn)在12h的時候mi R-206的水平降至最低點,與對照組相比具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。Western-blot檢測ZFP580的表達水平,結果顯示同樣在12h時ZFP580的表達水平達到最高,與對照組相比具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。故在隨后的實驗當中,時間節(jié)點選取12h作為實驗刺激最佳時間點。(2)SMa-actin、SM22a、Smad2/3、phospho-Smad2/3的表達水平:利用TGF-β(2ng/ml)刺激VSMC不同時間點均導致phospho-Smad2/3的升高,隨著刺激時間的延長呈現(xiàn)著表達減少的趨勢。而Smad2/3的表達各組間無明顯差異。TGF-β可誘導大鼠VSMC由合成表型向收縮表型的轉換,促進VSMC的分化,在實驗當中隨著TGF-β的刺激,平滑肌細胞的分化標記物SMa-actin、SM22a與對照組相比表達顯著上調(diào)(P0.05)。(3)SB431542減少TGF-β(2ng/ml)刺激導致的ZFP580、SMa-actin、SM22a表達水平的升高:選取20μM的SB431542對VSMC進行預處理,2h后加入TGF-β(2ng/ml)刺激VSMC12h,對照組加入等量DMSO預處理細胞余處理相同,以空白對照組為參照。從結果當中發(fā)現(xiàn),在預先加入SB431542之后明顯降低了TGF-β(2ng/ml)誘導ZFP580的表達上調(diào)(P0.05),phospho-Smad2/3的表達水平較對照組明顯降低(P0.05)。與此同時,Western-blot檢測SMa-actin、SM22a的表達水平結果顯示:SMa-actin、SM22a的表達較對照組相比均不同程度的降低(P0.05)。(4)SB431542減少TGF-β(2ng/ml)刺激導致的mi R-206水平的下調(diào):選取20μM的SB431542對VSMC進行預處理,2h后加入TGF-β(2ng/ml)刺激VSMC12h,隨后利用Realtime-PCR測定mi R-206的表達水平,結果顯示mi R-206的表達水平較對照組上調(diào)了大約2.5倍(P0.05)。(5)慢病毒過表達mi R-206:攜帶mi R-206基因慢病毒載體按10 MOI感染大鼠VSMC 72小時后,在倒置熒光顯微鏡488nm激發(fā)光下觀察綠色熒光產(chǎn)生情況,細胞轉染效率可達到80%以上,Realtime-PCR檢測VSMC中mi R-206的基因表達水平。結果顯示Lv-GFP組與對照組相比沒有明顯差異(P0.05),Lv-rno-mi R-206轉染組與對照組組相比,mi R-206的基因表達水平顯著增高(P0.05)。在慢病毒轉染后,加入TGF-β(2ng/ml)刺激VSMC12h,對照組選取正常的VSMC加入等量的TGF-β(2ng/ml)。在隨后的結果中發(fā)現(xiàn):Western-blot檢測SMa-actin、SM22a的表達水平對比對照組顯著降低(P0.05)。而mi R-206的基因表達水平較對照組降低(P0.05)。(6)過表達或低表達mi R-206慢病毒感染大鼠VSMC72h后,。Western-blot檢測ZFP580的表達水平,結果顯示:Lv-rno-mi R-206感染組與對照組相比,ZFP580的表達水平下調(diào)(P0.05),mi R-206低表達感染組與對照組相比,ZFP580的表達水平顯著上升(P0.05)。(7)過表達或低表達ZFP580慢病毒感染大鼠VSMC72h后。Western-blot檢測ZFP580的表達水平,結果顯示:高表達ZFP580感染組與對照組相比,SMa-actin與SM22a的表達水平上調(diào)(P0.05),低表達ZFP580感染組與對照組相比,SMa-actin、SM22a的表達水平顯著上升(P0.05)。(8)熒光素酶報告實驗(Luciferase)對mi R-206與ZFP580進行外源性驗證:克隆ZFP580的3'UTR區(qū)域,構建到熒光素酶報告基因載體p GL-3M中。293細胞轉染mi R-206過表達及對照病毒,隨后將報告基因載體和內(nèi)參質(zhì)粒p RL-CMV在脂質(zhì)體lipofectin 2000介導下共轉染細胞轉染mi R-206過表達的293細胞。48h后,檢測Luciferase活性,結果顯示:mi R-206過表達組p GL-3M的報告活性顯著降低,提示mi R-206可與ZFP580的3'UTR區(qū)域結合。結論:TGF-β可以促進平滑肌細胞由合成型向收縮型轉換,并且上調(diào)VSMC分化標記物SMa-actin、SM22a的表達水平,TGF-β通過經(jīng)典的Smad2/3通路調(diào)控micro RNA-206與ZFP580的表達,過表達mi R-206可以造成SMa-actin、SM22a及ZFP580的表達降低,抑制平滑肌細胞的分化。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R541.4

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 韓勁草,劉喜林,顧海波,陳松林,李宜富;同強度不同波長β射線培養(yǎng)液對兔血管平滑肌細胞生長的影響[J];中國醫(yī)藥導刊;2004年01期

2 徐正云,任國珍,馬愛群;干細胞分化為平滑肌細胞參與血管病變[J];中國心血管雜志;2005年03期

3 武曉靜,黃嵐,趙剛,晉軍,張波,宋明寶,蔣世忠;內(nèi)皮細胞表型改變對平滑肌細胞表型轉換及遷移的作用[J];高血壓雜志;2003年05期

4 王春;許燦新;郭紫芬;李君牧;羅迪賢;廖端芳;李凱;;無或低血清條件下高壓培養(yǎng)促進平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞生長[J];中南醫(yī)學科學雜志;2011年02期

5 洪方耀;;平滑肌細胞培養(yǎng)在動脈粥樣硬化研究中的應用[J];河北醫(yī)藥;1984年05期

6 劉貴生,卞紅磊,武惠珍,李淑榮,雷建章;消化道平滑肌細胞間的機械連接和通訊連接[J];電子顯微學報;2002年05期

7 鄧R，

本文編號：1180603