本文關(guān)鍵詞：DJ-1通過激活Nrf2信號通路上調(diào)抗氧化酶介導(dǎo)心肌細(xì)胞缺氧預(yù)適應(yīng)延遲保護

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【摘要】：目的:從Nrf2信號通路及其所調(diào)控的抗氧化酶(Mn SOD、HO-1)表達改變的角度探討DJ-1介導(dǎo)心肌細(xì)胞缺氧預(yù)適應(yīng)(HPC)延遲保護的分子機制。方法:1.利用親本H9c2細(xì)胞以及DJ-1沉默的H9c2/DJ-1 si RNA細(xì)胞,分別經(jīng)p Flag-h DJ-1重組載體或?qū)φ湛召|(zhì)粒p Flag瞬時轉(zhuǎn)染24 h后,建立HPC模型;HPC 24 h后,通過檢測以下變化,以求觀察DJ-1不同表達水平對HPC預(yù)處理H9c2細(xì)胞內(nèi)Nrf2信號通路的影響:①Western Blot檢測細(xì)胞內(nèi)DJ-1蛋白表達的變化;②免疫共沉淀(Co-IP)檢測Nrf2-Keap1的解離情況;③Western Blot檢測Nrf2核轉(zhuǎn)位變化;④染色質(zhì)免疫共沉淀(Ch IP)法檢測胞核內(nèi)Nrf2與HO-1及Mn SOD基因啟動子區(qū)內(nèi)抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合的變化。2.利用親本H9c2細(xì)胞以及DJ-1沉默的H9c2/DJ-1 si RNA細(xì)胞,分別經(jīng)p Flag-h DJ-1重組載體或?qū)φ湛召|(zhì)粒p Flag瞬時轉(zhuǎn)染24 h后,建立HPC模型;HPC 24 h后,通過Western Blot檢測細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶(Mn SOD、HO-1)蛋白表達的變化,以求觀察DJ-1不同表達水平對HPC預(yù)處理H9c2細(xì)胞內(nèi)Mn SOD、HO-1蛋白表達的影響。3.利用親本H9c2細(xì)胞以及DJ-1沉默的H9c2/DJ-1 si RNA細(xì)胞,分別經(jīng)p Flag-h DJ-1重組載體或?qū)φ湛召|(zhì)粒p Flag瞬時轉(zhuǎn)染24 h后,各組細(xì)胞分別用Nrf2si RNA或陰性對照si RNA(NC si RNA)轉(zhuǎn)染24 h,隨后建立HPC模型;HPC 24h后,通過Western Blot檢測細(xì)胞內(nèi)Nrf2及抗氧化酶(Mn SOD、HO-1)蛋白表達的變化,以求觀察Nrf2信號通路的抑制對DJ-1所依賴的HPC上調(diào)H9c2細(xì)胞內(nèi)Mn SOD、HO-1蛋白表達的影響。4.利用親本H9c2細(xì)胞以及DJ-1沉默的H9c2/DJ-1 si RNA細(xì)胞,分別經(jīng)p Flag-h DJ-1重組載體或?qū)φ湛召|(zhì)粒p Flag瞬時轉(zhuǎn)染24 h后,各組細(xì)胞分別用Nrf2si RNA或陰性NC si RNA轉(zhuǎn)染24 h,隨后建立HPC延遲保護模型和缺氧/復(fù)氧(H/R)損傷模型,通過檢測以下變化,以求觀察Nrf2信號通路的抑制對DJ-1所介導(dǎo)的HPC延遲保護的影響:①MTT法檢測各實驗組心肌細(xì)胞存活率的變化;②根據(jù)試劑盒說明分別檢測各組細(xì)胞內(nèi)LDH活性變化;③應(yīng)用比色法測定MDA含量;④流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)含量的變化。結(jié)果:1.在H9c2細(xì)胞,HPC 24 h后能顯著上調(diào)DJ-1蛋白表達,同時促進Nrf2與其抑制蛋白Keap1解離,并促進Nrf2入核,增加Nrf2在胞核內(nèi)與HO-1及Mn SOD基因啟動子區(qū)內(nèi)ARE的結(jié)合。然而,在DJ-1低表達的H9c2/DJ-1 si RNA細(xì)胞,HPC上述效應(yīng)被逆轉(zhuǎn)。此外,H9c2/DJ-1 si RNA細(xì)胞經(jīng)p Flag-h DJ-1轉(zhuǎn)染進行回復(fù)實驗后,DJ-1蛋白表達恢復(fù),同時伴隨HPC上述效應(yīng)的恢復(fù)。2.在H9c2細(xì)胞,HPC 24 h后能顯著上調(diào)HO-1及Mn SOD蛋白表達。然而,在DJ-1低表達的H9c2/DJ-1 si RNA細(xì)胞,DJ-1沉默對HPC所誘導(dǎo)的HO-1及Mn SOD蛋白表達上調(diào)呈現(xiàn)抑制效應(yīng)。同樣,H9c2/DJ-1 si RNA細(xì)胞經(jīng)p Flag-h DJ-1轉(zhuǎn)染后,HPC上調(diào)HO-1及Mn SOD蛋白表達的效應(yīng)也被恢復(fù)。3.H9c2細(xì)胞經(jīng)Nrf2 si RNA處理后產(chǎn)生DJ-1沉默相似效應(yīng),對HPC所誘導(dǎo)的HO-1及Mn SOD蛋白表達上調(diào)呈現(xiàn)抑制效應(yīng)。更為重要的是,H9c2/DJ-1si RNA細(xì)胞經(jīng)p Flag-h DJ-1轉(zhuǎn)染后,HPC上調(diào)HO-1及Mn SOD蛋白表達的回復(fù)效應(yīng)也被Nrf2 si RNA所逆轉(zhuǎn)。4.在H9c2細(xì)胞,HPC 24 h后可顯著提高H/R損傷心肌細(xì)胞的生存率,抑制LDH的活性;并能顯著減少H9c2心肌細(xì)胞H/R過程中所產(chǎn)生的活性氧(ROS),同時減少MDA的生成。然而,在DJ-1沉默的H9c2/DJ-1 si RNA細(xì)胞,HPC上述效應(yīng)被逆轉(zhuǎn)。更為有趣的是,H9c2細(xì)胞經(jīng)Nrf2 si RNA處理后同樣產(chǎn)生DJ-1沉默相似效應(yīng),對HPC抗H/R所誘發(fā)的氧化應(yīng)激,產(chǎn)生延遲保護作用呈現(xiàn)抑制效應(yīng)。此外,在H9c2/DJ-1 si RNA細(xì)胞,Nrf2 si RNA也逆轉(zhuǎn)DJ-1表達恢復(fù)對HPC延遲保護的回復(fù)效應(yīng)。結(jié)論:DJ-1介導(dǎo)心肌細(xì)胞HPC延遲保護的分子機制與其激活Nrf2信號通路,進而上調(diào)Nrf2所調(diào)控的抗氧化酶Mn SOD、HO-1的蛋白表達有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R542.2

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