本文關(guān)鍵詞：蛋白磷酸酶2A調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞遷移的實驗研究

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【摘要】：背景:缺血性心臟病(IHD)是由于冠狀動脈循環(huán)改變引起冠脈血流和心肌需求之間不平衡而導致的心肌損害,其病理改變是缺血區(qū)心肌細胞因缺血缺氧而壞死,梗死區(qū)逐漸被纖維疤痕所替代,殘余心肌則代償性肥厚,發(fā)生心室重構(gòu),而心室重構(gòu)正是造成心梗患者頑固性心力衰竭和死亡的主要原因,雖然藥物及介入等治療手段發(fā)展日新月異,但目前仍無法從根本上逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)及后續(xù)的心力衰竭。骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)可促使心肌細胞分裂及再生,修復病變的心肌組織,并維持心臟的自穩(wěn)態(tài),改善心臟功能,BMSCs移植已作為治療心衰的一種手段。近年來大量研究發(fā)現(xiàn):BMSCs在心肌組織修復過程中存在遷移。反應(yīng)性BMSCs是如何遷移到病變心肌組織的,目前已有大量研究表明趨化因子及蛋白磷酸激酶參與BMSCs的遷移,而蛋白磷酸酶對BMSCs的遷移作用方面的研究報道尚少。目的:研究蛋白磷酸酶2A(PP2A)對本底水平及SDF-1/CXCR4軸介導的骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)遷移的調(diào)控;探尋SDF-1/CXCR4軸介導的BMSCs遷移過程中可能發(fā)揮作用的PP2A功能性調(diào)節(jié)亞基。方法:本實驗以體外培養(yǎng)的SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)為研究模型,采用PP2A的特異性抑制劑,并結(jié)合脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)導入si RNA,從不同的角度調(diào)節(jié)PP2A的活性,并采用劃痕實驗和Transwell遷移小室實驗評價PP2A對BMSCs遷移的調(diào)控作用。(1)劃痕實驗(wound-healing):分別用12孔板培養(yǎng)不同處理的各組細胞,每孔接種細胞數(shù)控制為1.0×105/ml,進行劃痕實驗,在顯微鏡下觀察劃痕修復的過程,比較不同處理組細胞水平運動能力的差異。(2)Transwell小室體外遷移實驗:取生長狀態(tài)良好的BMSCs細胞培養(yǎng)48h后,消化并收獲細胞,用無血清DMEM低糖培養(yǎng)基洗3次,分別接種2.0×105個細胞于已行各組處理因素浸潤的Transwell小室中(濾膜微孔直徑8μm),行遷移實驗。遷移4h后剪下濾膜,用DAPI熒光染液染色,在20倍熒光顯微鏡下,每孔計數(shù)5個視野的細胞數(shù),并取平均值,比較不同處理因素下BMSCs垂直運動能力的差異。取生長狀態(tài)良好的BMSCs分別進行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染si NC和si PPP2Ca,前者為對照組,后者沉默PP2A催化亞基PPP2Ca,采用Transwell小室遷移實驗,通過與對照組的比較,評價沉默PPP2Ca后BMSCs遷移能力的變化。通過實時定量PCR檢測SDF-1刺激后PP2A主要調(diào)節(jié)亞基的表達變化,探尋SDF-1介導BMSCs遷移過程中可能起作用的功能性調(diào)節(jié)亞基。結(jié)果:(1)Transwell小室遷移實驗中,10n M、25n M、50n M三個OA梯度濃度組遷移細胞數(shù)均減少,較對照組有統(tǒng)計學差異(p0.05);BMSCs遷移能力與OA濃度呈負相關(guān),OA 10n M組與OA 25n M組遷移到濾膜上的細胞數(shù)的差異無統(tǒng)計學意義(p0.05),OA 50n M組與OA 10n M組和OA 25n M組均有差異(p0.05)。SDF-1與OA共刺激組BMSCs的遷移能力較單SDF-1刺激組明顯降低(p0.05)(2)劃痕實驗中,本底水平BMSCs遷移的距離比較,OA作用下BMSCs的劃痕愈合距離明顯小于對照組,12h時間點OA組與對照組無統(tǒng)計學差異(p0.05),24h、48h時間點較對照組均有差異(p0.05)。驗證SDF-1/CXCR4軸的趨化作用,引入SDF-1作為遷移的化學誘導物后,SDF-1和OA共刺激組在12h、24h、48h的劃痕愈合距離較SDF-1組均明顯減少,有統(tǒng)計學差異(p0.05)。(3)si PPP2Ca轉(zhuǎn)染后,PPP2Ca表達降為對照組的8.88±1.52%(p0.05)。轉(zhuǎn)染si-PPP2Ca的BMSCs遷移能力較對照組明顯減弱(p0.05);引入SDF-1刺激后,轉(zhuǎn)染si PPP2Ca的BMSCs的遷移能力與對照組相比,遷移能力有明顯減弱(p0.05)。(4)骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)SDF-1刺激后,PP2A調(diào)節(jié)亞基PPP2R2B表達量上調(diào)為209.37±41.03%;(p0.05),STRN3表達量下調(diào)為39.58±10.77。結(jié)論:1、以PP2A化學抑制劑OA抑制PP2A磷酸酶活性,本底水平及SDF-1誘導下的BMSCs的遷移能力均受到抑制。2、以si RNA方式沉默PP2A催化亞基PPP2Ca,本底水平及SDF-1誘導下的BMSCs的遷移能力均受到抑制。3、PP2A調(diào)節(jié)亞基B亞群的PPP2R2B和B”’亞群的STRN3的表達受SDF-1的調(diào)控。SDF-1可以誘導BMSCs中PPP2R2B高表達,同時BMSCs中STRN3的表達受SDF-1的抑制。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R541

【參考文獻】

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1 張紅珊;方建培;蘇浩彬;楊e，

本文編號：1143093