本文關(guān)鍵詞：RNA干擾靶向沉默SPAG6基因?qū)θ薓DS細(xì)胞體內(nèi)外生長的影響

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【摘要】：目的構(gòu)建靶向沉默SPAG6基因的pGC-SPAG6-shRNA重組慢病毒載體,從體內(nèi)外兩方面探討SPAG6基因?qū)θ斯撬柙錾惓＞C合征(MDS)細(xì)胞生長的影響,明確SPAG6基因在MDS發(fā)生中的作用。方法1、人SPAG6基因RNAi'慢病毒載體的構(gòu)建及驗證：以慢病毒pGC-GV-GFP為載體,設(shè)計并構(gòu)建3條針對SPAG6基因的shRNA慢病毒表達(dá)載體。轉(zhuǎn)染人MDS細(xì)胞株SKM-1細(xì)胞,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率,qRT-PCR及Western blot驗證SPAG6基因的干擾效果,篩選最佳靶點。2、SPAG6-shRNA'漫病毒載體對SKM-1細(xì)胞生長的影響：利用qRT-PCR檢測SPAG6在SKM-1細(xì)胞中的表達(dá)情況,CCK-8法檢測SPAG6基因沉默對SKM-1細(xì)胞增殖活性的影響,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡,并利用qRT-PCR及Western blot檢測部分凋亡相關(guān)分子的表達(dá)變化。3、SPAG6-shRNA慢病毒載體對SKM-1細(xì)胞生長影響的體內(nèi)研究：SPAG6-shRNA及NC-shRNA慢病毒載體穩(wěn)定感染SKM-1細(xì)胞,兩組細(xì)胞分別接種于免疫缺陷的NOD/SCID小鼠皮下,建立MDS荷瘤小鼠模型。觀察SPAG6基因干擾后移植瘤的生長情況,并利用TUNEL法檢測腫瘤組織的原位細(xì)胞凋亡。結(jié)果1、SPAG6-shRNA慢病毒載體成功得到,流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率均在60%以上。QRT-PCR及Western blot結(jié)果顯示SPAG6-shRNA3慢病毒載體的敲除效率最高,為最佳靶點。2、SPAG6在SKM-1細(xì)胞中表達(dá)明顯增高,靶向沉默SPAG6基因后,SKM-1細(xì)胞的生長受抑,O1D值較陰性對照組相比降低(P0.05)。干擾組細(xì)胞的凋亡比例為(16.42±3.27)%,明顯高于對照組[(4.12±0.52)%,P=0.024],而兩組間的細(xì)胞周期并無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。另外,SPAG6干擾組細(xì)胞內(nèi)caspase3、caspase8、caspase9及p53的表達(dá)水平明顯增高。3、在NOD/SCID小鼠皮下成功建立SKM-1細(xì)胞移植瘤,SPAG6干擾組瘤塊的體積及重量均小于對照組,并且TUNEL法結(jié)果顯示干擾組瘤塊組織的原位細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組(SPAG6-shRNA 48.33±2.52% vs. NC-shRNA 18.33±3.51%, P=0.000)結(jié)論SPAG6-shRNA慢病毒載體成功構(gòu)建,能有效降低SPAG6基因mRNA及蛋白的表達(dá)水平。SPAG6基因在人MDS細(xì)胞株SKM-1中表達(dá)增高,利用SPAG6-shRNA'漫病毒靶向沉默SPAG6后,SKM-1細(xì)胞的生長受抑,細(xì)胞凋亡增加。其途徑可能是SPAG6基因表達(dá)的降低可上調(diào)caspase蛋白及p53的表達(dá),誘導(dǎo)凋亡信號通路的活化。提示高表達(dá)的SPAG6可能通過抑制MDS細(xì)胞的凋亡而促進(jìn)其生長,為進(jìn)一步研究MDS的靶向治療提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R551.3

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本文編號：1142010