本文關(guān)鍵詞：α1A和AT1受體通過特定PKC亞型調(diào)節(jié)hERG鉀通道的分子基礎(chǔ)

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【摘要】：心律失常,尤其是嚴(yán)重的室性心律失常,是致心血管病患者死亡的主要原因之一。揭示心律失常發(fā)生的細(xì)胞分子機(jī)制,對于心血管疾病治療有重要意義。先天遺傳基因改變或后天獲得性因素引起心肌離子通道的結(jié)構(gòu)和/或功能紊亂是產(chǎn)生心律失常的重要分子基礎(chǔ)[1-5]。其中獲得性離子通道功能的改變與神經(jīng)體液系統(tǒng)的過度激活(特別是交感腎上腺素和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng))密切相關(guān)。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道,腎上腺素?1A受體和血管緊張素II(Ang II)AT1受體可調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞膜上的離子通道功能,是心血管疾病病理情況下通道功能異常的重要原因[6-10]。蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)作為細(xì)胞功能調(diào)控的重要分子,中介多種神經(jīng)體液因子作用,在離子通道功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[11-19]。依據(jù)PKC結(jié)構(gòu)與激活機(jī)制分為三類:傳統(tǒng)型PKC(c PKC,包括α、βI、βII和γ),新型PKC(n PKC,包括δ、ε、π和θ),非典型PKC(a PKC,包括ζ、?/λ)。已知不同動(dòng)物種屬的心肌組織均存在PKCα、βI、βII、γ、ε、?、?等亞型,尤其富含PKC?和PKCε亞型[20-22]。有研究表明,對通道動(dòng)力學(xué)不同的調(diào)控方式提示可能不同的PKC亞型中介兩種G蛋白偶聯(lián)受體的作用[23-30],腎上腺素?1A受體和血管緊張素II(Ang II)AT1受體激動(dòng)均可通過PKC信號通路調(diào)控心臟HERG鉀通道功能[24,31-33]。因此,本研究主要用分子生物學(xué)方法,在穩(wěn)定表達(dá)HERG鉀通道的HERG-HEK293細(xì)胞,以及成年豚鼠心臟,分給予A61603(?1A受體激動(dòng)劑)、AngⅡ(AT1受體激動(dòng)劑),測定受體激動(dòng)后不同亞型磷酸化PKC含量變化(PKC自身的磷酸化為其活化的表現(xiàn)),確定PKC激動(dòng)的亞型特異性。利用免疫共沉淀(Co IP)方法進(jìn)一步分析激活的PKCε、PKCα與HERG鉀通道的空間關(guān)系,為兩種G蛋白偶聯(lián)受體通過不同亞型PKC調(diào)節(jié)HERG鉀通道功能提供分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。目的:利用特異性磷酸化PKC抗體檢測?1A和AT1受體激動(dòng)后不同PKC亞型的活化以及其與HERG鉀通道的關(guān)系方法:在穩(wěn)定表達(dá)HERG鉀通道c DNA的HERG-HEK293細(xì)胞上瞬轉(zhuǎn)?1A或AT1受體后,分別加入A61603或AngⅡ10分鐘后,提細(xì)胞膜蛋白,進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%BSA封閉液封閉2小時(shí)后,依次加入特異性p-PKC?(磷酸化PKC?抗體),p-PKCε(磷酸化PKCε抗體)和GAPDH(內(nèi)參蛋白)一抗過夜后,洗膜孵熒光二抗,用Odyssey 9120雙色紅外激光成像系統(tǒng)儀器掃描,分析蛋白條帶,檢測目的蛋白表達(dá)的變化。目的蛋白的相對含量以目的蛋白與其GAPDH的灰度值比值表示,并均以對照組的灰度比值1,計(jì)算出給藥后目的蛋白表達(dá)量的變化。用Origin Pro 7.5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)用n表示。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間數(shù)據(jù)比較,當(dāng)P0.05時(shí),認(rèn)為組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用豚鼠左心室心肌組織重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)。完整豚鼠心臟快速取出后,置Langendorff灌流裝置,臺氏液灌流待穩(wěn)定后,灌流A61603或AngⅡ10分鐘,提取左心室組織膜蛋白做Western Blot,檢測磷酸化PKC?和PKCε含量,數(shù)據(jù)處理同上。為驗(yàn)證磷酸化PKC?和PKCε與HERG鉀通道的關(guān)系,做免疫共沉淀(Co IP)實(shí)驗(yàn)。依次完成裂解,沉淀,預(yù)清除,抗體混懸過夜,加瓊脂糖珠,洗脫等步驟,將所得蛋白液進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn),檢測HERG鉀通道蛋白,p-PKC?和p-PKCε。結(jié)果:1?1A和AT1受體激動(dòng)后,不同PKC亞型的活化Western blot結(jié)果顯示,在穩(wěn)態(tài)表達(dá)HERG-HEK293細(xì)胞,?1受體激動(dòng)劑A61603(1μM)處理細(xì)胞明顯提高p-PKC?表達(dá)量,約為control組的1.2倍(P0.05,n=3),p-PKC?含量變化與PKC激動(dòng)劑PMA相近,然而,A61603并不影響p-PKCε的含量;豚鼠心臟灌流A61603后,p-PKC?蛋白含量為control組的1.1(P0.05,n=3)倍;p-PKCε含量雖有變化,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上實(shí)驗(yàn)表明,?1A受體激動(dòng)劑可選擇性激活PKC?亞型。HERG-HEK293細(xì)胞瞬轉(zhuǎn)AT1受體,加入AngⅡ(100n M)孵育后,Western blot結(jié)果顯示p-PKC?含量約為control組的1.2倍(P0.05,n=3),p-PKCε蛋白含量約為control組的1.2倍,表達(dá)變化與PMA相近;豚鼠心臟灌流AngⅡ后,左心室組織膜蛋白p-PKC?蛋白含量約為control組的1.2倍(P0.05,n=3),p-PKCε蛋白含量為control組的1.3倍(P0.05,n=3),AngⅡ?qū)-PKC?,p-PKCε蛋白表達(dá)的變化均與PMA相似。以上實(shí)驗(yàn)表明,AT1受體激動(dòng)劑可以選擇性的激動(dòng)PKC?和PKCε,且對PKCε的激動(dòng)作用更強(qiáng)。2激活的PKC?和PKCε與h ERG鉀通道的相互關(guān)系。豚鼠心臟灌流A61603或AngⅡ后,左心室組織做Co IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證蛋白-蛋白相互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,用特異性抗體免疫沉淀HERG蛋白后,Western blot顯示p-PKC?和p-PKCε蛋白條帶均呈陽性;提示p-PKC?、p-PKCε與HERG通道共定位在細(xì)胞膜上。結(jié)論:1?1A受體激動(dòng)劑可以選擇性的激動(dòng)PKC?;而對PKCε,?1A受體激動(dòng)劑未見明顯作用;AT1受體激動(dòng)劑可以同時(shí)激動(dòng)PKC?與PKCε,但激動(dòng)程度有一定差異,在豚鼠心室組織對PKCε作用更強(qiáng)。2免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)提示,p-PKC?和p-PKCε與HERG通道蛋白存在共定位現(xiàn)象,提示激活的PKC?和PKC可能直接調(diào)控通道功能。
【關(guān)鍵詞】：GPCR PKC亞型 p-PKC? p-PKCε ?1A受體 AT1受體 HERG鉀通道
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R541.7
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫11-12
• 前言12-13
• 材料與方法13-23
• 結(jié)果23-24
• 附圖24-32
• 附表32-34
• 討論34-35
• 結(jié)論35-36
• 參考文獻(xiàn)36-40
• 綜述 內(nèi)吞作用對心臟電壓依賴鉀通道的調(diào)節(jié)40-50
• 參考文獻(xiàn)46-50
• 致謝50-51
• 個(gè)人簡歷51

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本文編號：1129060