本文關(guān)鍵詞：重組人腫瘤壞死因子α影響人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性及PD-L1蛋白表達(dá)的研究

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【摘要】：研究背景 冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(CHD)是指冠狀動(dòng)脈粥樣硬化使冠脈血管腔狹窄或阻塞,導(dǎo)致心肌缺血缺氧或壞死而引起的疾病,是動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致器官病變的最常見類型,發(fā)病率在我國(guó)呈逐年攀升趨勢(shì),是嚴(yán)重危害人類健康的常見病。本病由多種原因綜合所致,與年齡、性別、血壓、血脂、血糖、遺傳等多種因素相關(guān),因此,本病病因及發(fā)病機(jī)制成為近幾十年來醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。早期研究中,人們發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈血管內(nèi)膜形成粥樣斑塊是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(CHD)的主要發(fā)病原因,病變特征是血中脂質(zhì)在動(dòng)脈內(nèi)膜沉積,引起內(nèi)膜局灶性纖維性增厚及其深部成分的壞死、崩解,形成粥樣物,所以早期研究者認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化是因脂質(zhì)沉淀于血管內(nèi)皮所致,即傳統(tǒng)的脂質(zhì)沉淀理論。血脂增高被認(rèn)為是冠心病的重要高危因素,但統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)僅有約50%的冠心病患者表現(xiàn)為血脂增高。進(jìn)一步研究表明,動(dòng)脈粥樣硬化不僅是一種單純的脂肪沉積疾病,機(jī)體的慢性炎癥機(jī)制在粥樣硬化斑塊的形成及發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。上世紀(jì)九十年代Dr.Russell Ross首次提出了“損傷反應(yīng)”理論,認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化是多種損傷因素導(dǎo)致的發(fā)生在血管內(nèi)膜的慢性炎癥反應(yīng),該理論使得人們對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制的認(rèn)識(shí)有了質(zhì)的提高。Dr.Russell Ross認(rèn)為,動(dòng)脈粥樣硬化早期斑塊形成始于一系列機(jī)械學(xué)和生化學(xué)刺激引起的功能性或者形態(tài)學(xué)內(nèi)皮損傷,細(xì)胞粘附分子表達(dá)增加,合成細(xì)胞因子如白介素-8(IL-8)、單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)等,單核及巨噬細(xì)胞隨后被激活并聚集在動(dòng)脈壁,接下來,脂肪積聚、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子進(jìn)一步釋放以及平滑肌細(xì)胞和淋巴細(xì)胞激活增生。伴隨著這些過程的繼續(xù),粥樣斑塊逐漸成長(zhǎng)和成熟。當(dāng)富含脂肪的細(xì)胞死亡,便形成斑塊的核心部分,導(dǎo)致斑塊重構(gòu)和纖維化或者最終破裂,血小板在內(nèi)皮細(xì)胞破損處聚集,形成血栓,常常導(dǎo)致急性冠脈綜合征�？傊�,巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、血小板以及這些細(xì)胞釋放的各種因子(如細(xì)胞素、生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子和氧自由基等)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)機(jī)制參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生,促進(jìn)了AS的發(fā)展、惡化。炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化過程中起到了關(guān)鍵作用,并與疾病預(yù)后有關(guān)。 研究證實(shí),動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)非�；钴S,有大量的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),活動(dòng)性炎癥反應(yīng)亦可促使穩(wěn)定性粥樣斑塊轉(zhuǎn)變?yōu)椴环�(wěn)定性斑塊,這是冠狀動(dòng)脈內(nèi)急性血栓形成的誘因。因此我們認(rèn)為,阻斷血管內(nèi)皮的炎癥反應(yīng)或許可以成為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的預(yù)防和治療途徑。 程序性死亡因子配體1(programmed cell death ligand1, PD-L1、B7-H1或CD274)是由290個(gè)氨基酸構(gòu)成的Ⅰ型跨膜蛋白。最初因?yàn)楸话l(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),人們推測(cè)其與腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān),但隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)除腫瘤細(xì)胞以外,PD-L1在多種組織細(xì)胞和炎癥細(xì)胞上均有表達(dá),如血管內(nèi)皮細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞、星形細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、骨髓源性肥大細(xì)胞、胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等；PD-L1的功能除與腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)以外,也與多種病理過程有著密切的關(guān)系,如移植免疫反應(yīng)、自身免疫性疾病、微生物感染等。近年來多項(xiàng)研究認(rèn)為,PD-L1作為B7家族分子的成員,其受體為程序性死亡因子1(programmed cell death1receptor, PD-1或CD279)=PD-1的胞漿區(qū)尾部有2個(gè)酪氨酸殘基,N端酪氨酸殘基參與構(gòu)成一個(gè)免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine based inhibitory motif, ITIM), C端酪氨酸殘基則參與構(gòu)成一個(gè)免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序(immunoreceptor tyrosine-based switch motif,ITSM),其中ITSM高度保守,提示其具有重要功能。研究表明,當(dāng)PD-1與其配體結(jié)合時(shí),ITSM發(fā)生磷酸化,通過一系列的生化過程使下游的效應(yīng)分子去磷酸化,發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。PD-L1是PD-1的配體之一,與PD-1結(jié)合后發(fā)揮免疫調(diào)控作用。相關(guān)研究表明,PD-1/PD-L1信號(hào)系統(tǒng)對(duì)免疫機(jī)能的調(diào)節(jié)作用,與動(dòng)脈粥樣硬化的慢性炎癥機(jī)制同樣相關(guān)。Gotsman等研究冠狀動(dòng)脈斑塊時(shí),發(fā)現(xiàn)用熒光免疫技術(shù)可以探測(cè)到PD-L1表達(dá)于多處動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)。從PD-L1、PD-L2、LDL受體三種基因均敲除(triple knockout, TKO)小鼠體內(nèi)分離的APC能更強(qiáng)的刺激T細(xì)胞對(duì)ox-LDL的炎癥反應(yīng),與LDL受體敲除的小鼠相比,TKO小鼠主動(dòng)脈弓、降主動(dòng)脈的AS損傷區(qū)域增加了3倍。Lee等研究者發(fā)現(xiàn)冠心病患者外周血T淋巴細(xì)胞PD-1表型及樹突狀細(xì)胞PD-L1表型均較健康人的明顯降低。本課題組的前期研究表明,穩(wěn)定性心絞痛及急性冠脈綜合癥患者外周血T淋巴細(xì)咆PD-L1蛋白表達(dá)均較正常對(duì)照組明顯增加,由此推測(cè)PD-L1可能在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成過程中發(fā)揮了重要作用。 目前為止,細(xì)胞表達(dá)PD-L1蛋白以及PD-L1蛋白發(fā)揮免疫調(diào)控作用的完整機(jī)制仍未完全清晰,不同研究對(duì)象及使用不同刺激物,得出結(jié)果不盡相同,歸納起來,影響PD-L1表達(dá)的細(xì)胞信號(hào)通路可能為JAK/STAT信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路、MEK/Erk信號(hào)通路、NPM/ALK通路、MAPK通路等,并且與IRF-1和STAT-3轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)。p38MAPK信號(hào)通路是MAPK通路的重要分支,它通過使轉(zhuǎn)錄因子磷酸化而改變基因的表達(dá),參與多種細(xì)胞內(nèi)信息傳遞過程,能對(duì)廣泛的細(xì)胞外信號(hào)發(fā)生反應(yīng),介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化及死亡的全過程。本課題組前期研究結(jié)果表明,p38MAPK通路參與了樹突狀細(xì)胞分化表達(dá)PD-L1蛋白的調(diào)控過程,但是對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化過程啟動(dòng)并發(fā)展至關(guān)重要的血管內(nèi)皮細(xì)胞,尚無相關(guān)研究。鑒于此,本課題以體外培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象,利用炎癥因子TNF-a刺激模擬炎癥過程,觀察臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PD-L1的變化,首先明確TNF-a對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞PD-L1蛋白表達(dá)的影響；再以p38蛋白特異性抑制劑SB203580阻斷p38MAPK通路,重復(fù)TNF-a刺激,觀察臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PD-L1與p38MAPK信號(hào)通路的關(guān)系,探討TNF-a誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PD-L1蛋白的細(xì)胞分子機(jī)制,研究負(fù)性協(xié)同刺激信號(hào)系統(tǒng)(PD-1/PD-L)調(diào)控慢性炎癥過程的機(jī)理,為動(dòng)脈粥樣硬化的免疫機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。 第一部分TNF-α刺激導(dǎo)致臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞存活率下降 目的觀察不同濃度的TNF-α對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響,篩選出對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞有效且組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的TNF-α濃度梯度。 對(duì)象和方法 1.對(duì)象體外培養(yǎng)的健康人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs) 2.方法 2.1臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定 無菌條件下取新生兒臍帶約25厘米(中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供,產(chǎn)婦知情同意,過程符合赫爾辛基宣言中的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)),剪去兩端夾痕,擠出臍帶內(nèi)殘留血液,PBS反復(fù)沖洗至沖洗液無色。夾緊血管下端,從上端注入0.1%膠原酶Ⅰ與含EDTA的胰蛋白酶(0.125%)消化獲取臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,PBS離心沖洗兩遍洗去胰蛋白酶,用臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基將細(xì)胞接種于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶,置于恒溫培養(yǎng)箱中(37℃,5%C02)培養(yǎng),每12小時(shí)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及貼壁狀況,每48小時(shí)全量換培養(yǎng)基。約72小時(shí)后細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底,單層均勻排布,呈典型鋪路石樣。棄去培養(yǎng)基,PBS沖洗,胰蛋白酶消化,收獲細(xì)胞并傳代培養(yǎng)。試驗(yàn)所用細(xì)胞為第3-5代,內(nèi)皮細(xì)胞鑒定采用Ⅷ因子相關(guān)抗原熒光染色。 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基成分(每100ml培養(yǎng)基含：FBS20ml(20%)from Gibicol;Beta-ECGF5ng/ml from sigma；L-glutamine,1mM；Penicillin-Streptomycin；heparin2500U/100ml;M-19980ml from Gibicol。) 2.2臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凍存?zhèn)溆?至第3代細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,棄去上層培養(yǎng)基,貼壁的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞用無Ca2+、Mg2+的PBS輕柔沖洗2次以除去培養(yǎng)基成分,在每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入含EDTA的濃度為0.125%胰蛋白酶消化細(xì)胞,顯微鏡下觀察,待細(xì)胞由梭形回縮至球形時(shí)加入血清終止消化,PBS再次沖洗兩遍,加入成分為20%FBS、10ng/mLβ-ECGF、25U/mL肝素的M199培養(yǎng)基3ml,反復(fù)吹打至臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞脫離瓶壁懸浮于培養(yǎng)基中,調(diào)整細(xì)胞濃度至105個(gè)/ml,吸取3ml用于細(xì)胞鑒定及Cell Counting Kit-8(CCK-8)細(xì)胞活性檢測(cè)試驗(yàn),其余細(xì)胞經(jīng)1000轉(zhuǎn)/min、5min離心后,棄去上層培養(yǎng)基,加凍存液凍存于液氮中備用。凍存液配制：85%M199培養(yǎng)基、10%胎牛血清、5%DMSO。 2.3分組及CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 將濃度為105個(gè)/ml的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(第3代)置于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),按照1：3傳至第4代,至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,棄去培養(yǎng)基,PBS沖洗、胰蛋白酶消化、吹打收集細(xì)胞,加入HUVECs專用培養(yǎng)基重懸,再次調(diào)整濃度為105個(gè)/ml。按照8組、每組5復(fù)孔接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔100μl,編號(hào)為1,2,3,4,5,6,7,8組。另設(shè)一本底組編號(hào)為0,只加100μl全培養(yǎng)基,不含臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,用于檢測(cè)CCK-8實(shí)驗(yàn)本底值。共9組,45復(fù)孔。為減少試劑蒸發(fā)所致誤差,96孔板邊緣培養(yǎng)孔棄用并加PBS溶液填充。完畢后,將96孔板置于培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24h,預(yù)培養(yǎng)后加入HUVECs專用培養(yǎng)基、含TNF-α濃度為2μg/ml的培養(yǎng)基,調(diào)整每孔總?cè)萘恐?00μl。其中,1—8組含腫瘤壞死因子濃度分別為Ong/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml,60ng/ml,80ng/ml,100ng/ml,0組加專用培養(yǎng)基至200μL,不含臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及腫瘤壞死因子。繼續(xù)培養(yǎng)(37℃,5%CO2)48小時(shí)后加入Cell Counting Kit-8(CCK-8)細(xì)胞活力檢測(cè)試劑,每孔10μl,恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)4小時(shí)后酶標(biāo)儀下檢測(cè)450nm波長(zhǎng)處的吸光度值(OD值)。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件處理,計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用單因素方差分析(one-way ANOVA),兩兩比較采用LSD-t法,以P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1.臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 顯微鏡下觀察,原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞呈單層生長(zhǎng),形態(tài)為卵圓形,邊界清楚,細(xì)胞質(zhì)豐富,胞核呈橢圓形。培養(yǎng)2-3天后細(xì)胞鋪滿板底,呈梭形,邊界清楚,細(xì)胞質(zhì)豐富,胞核呈橢圓形,單層排列,分布均勻,貼壁生長(zhǎng),呈典型鋪路石樣。 2. Ⅷ因子相關(guān)抗原熒光染色 熒光顯微鏡下觀察,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見棕黃色顆粒,胞核為藍(lán)色,說明細(xì)胞內(nèi)有內(nèi)皮細(xì)胞特有的第Ⅷ因子相關(guān)抗原存在,對(duì)照組為陰性反應(yīng)。 3. CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果 從組1到組7,隨TNF-α濃度逐漸升高,各組細(xì)胞在450nm波長(zhǎng)下的吸光度值(OD value)逐漸降低(P0.05),從(0.721±0.0129)降至(0.548±0.0196),組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但組7與組8之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),我們認(rèn)為可能與濃度梯度過小有關(guān)。 結(jié)論 1.腫瘤壞死因子α(TNF-α)刺激對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性可產(chǎn)生明顯影響,5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、60ng/ml、80ng/ml的組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,80ng/ml、100ng/ml組間差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.擬選取0ng/ml、5ng/ml、20ng/ml、80ng/ml濃度分組進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。第二部分TNF-α對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分化表達(dá)PD-L1蛋白的影響 目的：采用不同濃度TNF-α持續(xù)刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,Western Blot方法檢測(cè)各組細(xì)胞PD-L1蛋白表達(dá)。探討TNF-α對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分化表達(dá)PD-L1蛋白的影響。 對(duì)象和方法 1.對(duì)象體外培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。 2.方法 2.1臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞解凍培養(yǎng)。將凍存于液氮中的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(3代)取出,迅速置于37℃恒溫水浴鍋中,約1-2分鐘后完全融化,將含有細(xì)胞的凍存液移至離心管中,經(jīng)1000轉(zhuǎn)／分、5分鐘離心,吸去上層凍存液,加入HUVECs專用培養(yǎng)基,反復(fù)混合均勻,移入25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。每12小時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài),每48小時(shí)全量換液。待細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,按照1：4傳代。 2.2實(shí)驗(yàn)分組及腫瘤壞死因子干預(yù)。待4代細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,換液加入含有腫瘤壞死因子的專用培養(yǎng)基,調(diào)整腫瘤壞死因子濃度分別為A組Ong/ml、B組5ng/ml、C組20ng/ml、D組80ng/ml。恒溫培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí),棄去上層培養(yǎng)基,PBS反復(fù)沖洗2遍,含EDTA的胰蛋白酶消化,加入PBS溶液反復(fù)吹打細(xì)胞至脫落懸浮,離心收獲各組細(xì)胞,PBS反復(fù)離心沖洗2遍,加入裂解液提取蛋白,BCA法總蛋白定量。調(diào)整上樣量為25μg總蛋白／樣本,上樣,電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉過夜。封閉完畢后PBST洗膜5次,加一抗,37℃反應(yīng)1.5h, PBS洗膜5次,加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗,37℃反應(yīng)1h, PBS洗膜5次。染色,曝光,采用BIORAD GELDOC XR凝膠成像系統(tǒng)依次顯影、定影,QuantityOne Basic軟件分析膠片中蛋白條帶。本步試驗(yàn)重復(fù)3次。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件處理,計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析多樣本比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),兩兩比較采用LSD-t法,以P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1.解凍后細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)正常,貼壁生長(zhǎng),呈梭形,單層排布,呈典型鋪路石樣。細(xì)胞質(zhì)豐富,胞核呈橢圓形。 2.隨TNF-a濃度逐漸升高,A、B、C、D四組細(xì)胞的PD-L1蛋白表達(dá)逐漸下降(P0.05),Western blot曝光顯色灰度比值分別為A組(1.797±0.1550),B組(1.512±0.1022),C組(1.108±0.0799),D組(0.845±0.0542),組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 腫瘤壞死因子α可明顯抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分化表達(dá)PD-L1蛋白。抑制強(qiáng)度與TNF-a濃度正相關(guān)。 第三部分TNF-a通過p38MAPK通路調(diào)控臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PD-L1 目的以p38蛋白特異性抑制劑SB203580阻斷p38MAPK信號(hào)通路后,觀察臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞受TNF-α刺激后PD-L1表達(dá)變化,探討臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PD-L1與p38MAPK信號(hào)通路的關(guān)系。 對(duì)象和方法 1.對(duì)象體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。 2.方法 2.1臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞解凍和培養(yǎng)。 將凍存于液氮中的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(3代)取出,迅速置于37℃恒溫水浴鍋中,約1-2分鐘后全部融化,將含有細(xì)胞的凍存液移至離心管中,經(jīng)1000轉(zhuǎn)/分、5分鐘離心,棄去上層凍存液,加入HUVECs專用培養(yǎng)基,反復(fù)混合均勻,種植于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。每12小時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài),每48小時(shí)全量換液。待細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,按照1：3傳至第4代。 2.2實(shí)驗(yàn)分組 將第4代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中,設(shè)3組,每組2復(fù)孔。根據(jù)是否使用TNF-α和p38MAPK通路抑制劑SB203580將實(shí)驗(yàn)分成三組,TNF-α濃度選擇80ng/ml, SB203580用二甲基亞砜(DMSO)溶解。 第一組為正常培養(yǎng)組：使用專用培養(yǎng)基孵育臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞48小時(shí)作為空白對(duì)照； 第二組為TNF-α干預(yù)組：使用專用培養(yǎng)基和配制好的含TNF-α濃度為2μg/ml的培養(yǎng)基,調(diào)整TNF-α濃度為80ng/ml,溫箱中培養(yǎng)48小時(shí)； 第三組為TNF-α(?)SB203580共同干預(yù)組：加入DMSO溶解的p38MAPK阻斷劑SB203580預(yù)處理1小時(shí),然后加入含TNF-α的培養(yǎng)基,調(diào)整TNF-α濃度為80ng/ml,置于溫箱中培養(yǎng)48小時(shí)。 2.3Western blot方法檢測(cè)PD-L1蛋白 收獲各組細(xì)胞,加入裂解液提取蛋白,BCA法總蛋白定量。調(diào)整上樣量為25μg總蛋白／樣本,上樣,電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉過夜。封閉完畢后PBST洗膜5次,加一抗,37℃反應(yīng)1.5h, PBS洗膜5次,加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗,37℃反應(yīng)1h, PBS洗膜5次。染色,曝光,采用BIORAD GELDOC XR凝膠成像系統(tǒng)依次顯影、定影,QuantityOne Basic軟件分析膠片中蛋白條帶。本步實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件處理,計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析多樣本比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),兩兩比較采用LSD-t法,以P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1. TNF-α干預(yù)組較正常培養(yǎng)組、TNF-α和SB203580共同干預(yù)組表達(dá)PD-L1明顯下降,依次分別為(0.486±0.0571)、(1.069±0.0401)、(1.215±0.0506),P0.05,組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常培養(yǎng)組、TNF-α和SB203580共同干預(yù)組表達(dá)PD-L1差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,正常培養(yǎng)組低于TNF-α和SB203580共同干預(yù)組。 結(jié)論 1. p38MAPK通路參與了TNF-α影響臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分化表達(dá)PD-L1蛋白的過程。 2.正常培養(yǎng)組PD-L1蛋白表達(dá)低于TNF-α和SB203580共同干預(yù)組,我們考慮可能是因?yàn)榇嬖诓糠謨?nèi)源性TNF-α或者其他細(xì)胞因子通過p38MAPK通路調(diào)控PD-L1蛋白表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：腫瘤壞死因子 程序性死亡因子配體1 CD274 p38MAPK通路 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R541.4
【目錄】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-25
• 前言25-27
• 第一章 腫瘤壞死因子-α抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性27-39
• 1.1 材料和對(duì)象27-29
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法29-31
• 1.3 結(jié)果31-34
• 1.4 討論34-35
• 1.5 參考文獻(xiàn)35-39
• 第二章 TNF-α對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分化表達(dá)PD-L1蛋白的影響39-54
• 2.1 材料和對(duì)象39-44
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法44-46
• 2.3 結(jié)果46-47
• 2.4 討論47-50
• 2.5 參考文獻(xiàn)50-54
• 第三章 TNF-α通過p38MAPK通路調(diào)控臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PD-L154-67
• 3.1 材料和對(duì)象54-59
• 3.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)象59
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法及分組59-61
• 3.4 結(jié)果61-62
• 3.5 結(jié)論62
• 3.6 討論62-64
• 3.7 參考文獻(xiàn)64-67
• 全文總結(jié)67-68
• 中英文縮略詞對(duì)照表68-69
• 攻讀學(xué)位期間成果69-70
• 致謝70-72

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6 安靜,黎鰲,楊宗城;胎兒臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);1990年03期

7 阮驪韜,曹鐵生,段云友,莊磊,孔新;同型半胱氨酸對(duì)體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ET的影響[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2002年22期

8 富晶;王虹艷;曲鵬;;銀杏葉提取物對(duì)脂多糖介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞低密度脂蛋白受體LOX-1表達(dá)的影響[J];大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2006年05期

9 郭鈺珍;陳漢平;;缺氧促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血紅素氧合酶表達(dá)及[Ca~(2+)]_i變化[J];中國(guó)病理生理雜志;2007年07期

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2 張飆;郝振林;黃玉林;張秋敏;楊奕;田陽(yáng);;燒傷病人血漿腫瘤壞死因子-α及其可溶性受體的變化[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第五次全國(guó)燒傷外科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];1997年

3 柴家科;申傳安;;腫瘤壞死因子對(duì)骨骼肌細(xì)胞內(nèi)泛素系統(tǒng)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)及意義[A];全國(guó)燒傷創(chuàng)面處理、感染專題研討會(huì)論文匯編[C];2004年

4 傅淑霞;邢玲玲;裴華穎;李紹梅;楊林;王彥;;瘦素和腫瘤壞死因子α在糖皮質(zhì)激素所致胰島素抵抗中的作用[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)腎臟病學(xué)分會(huì)2006年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2006年

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1 興業(yè)證券 王光清;腫瘤壞死因子上市能否起波瀾[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2003年

2 新華;新型腫瘤壞死因子NC進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2000年

3 東辰;二醫(yī)大研制出抗癌類新藥“重組人新型腫瘤壞死因子”[N];中國(guó)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報(bào);2001年

4 周清華 侯梅;新型重組人腫瘤壞死因子有化療增敏作用[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2003年

5 記者 黃才剛;慢性氣道炎與細(xì)胞因子失衡有關(guān)[N];健康報(bào);2000年

6 本報(bào)記者 王樂民;警惕腫瘤壞死因子抑制劑致真菌感染[N];健康報(bào);2008年

7 國(guó)文;腫瘤壞死因子抑制劑導(dǎo)致真菌感染[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2008年

8 邵建國(guó);類風(fēng)關(guān)治療,生物藥擔(dān)綱[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2010年

9 樊鳳輝;新型抗體有望同時(shí)治療兩種疾病[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2004年

10 劉長(zhǎng)云;睡眠剝奪影響人體免疫功能[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2003年

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10 甄學(xué)慧;瘦素、腫瘤壞死因子與妊娠期高血壓疾病的相關(guān)性研究[D];吉林大學(xué);2007年

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本文編號(hào)：1088306