本文關鍵詞：敲除CHOP增加小鼠心肌梗死急性期死亡率且不能改善心肌梗死后心室重構

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【摘要】：研究背景與目的心肌梗死是威脅人類健康的主要疾病之一,ST段抬高型心肌梗死是急性心肌梗死病的常見類型,具有較高的死亡率和致殘率,嚴重威脅人類健康,給患者家庭帶來沉重的經濟負擔和生活壓力。急性心肌梗死是心外膜冠狀動脈閉塞導所致,其結果是閉塞遠端的心肌組織缺血,若不能及時恢復冠狀動脈供血,缺血的心肌將永久性壞死。溶栓治療和經皮冠狀動脈介入治療等早期再灌注治療是最為有效和廣泛使用的治療手段。對于沒有機會接受再灌注治療的患者來說,通過藥物干預、基因治療、干細胞移植等手段改善心肌梗死后心室重構是一種合理的治療策略。內質網是參與膜蛋白和分泌蛋白折疊過程的重要細胞器。多種細胞應激,如缺血、缺氧、熱休克、基因突變、氧化應激等均可導致蛋白質合成增加,導致內質網功能受損,這些損傷內質網功能的刺激統(tǒng)稱內質網應激(ERS)。ERS過度或者被延長時,內質網通過多條信號通路激活凋亡信號,包括誘導C/EBP同源蛋白(CHOP)合成,激活JNK和裂解caspase-12。急性心肌梗死時冠狀動脈閉塞導致罪犯血管管轄區(qū)域心肌細胞急性缺血,風險區(qū)(AAR)心肌細胞缺血持續(xù)時間到達20分鐘及以上時,心內膜心肌細胞開始死亡,而且隨缺血時間推延逐漸擴展到心外膜形成透壁性心肌梗死。組織缺氧和營養(yǎng)供應不足將導致心肌細胞一系列生化改變和代謝改變。缺氧的心肌細胞氧化磷酸化受損,導致線粒體膜去極化,ATP缺失并抑制心肌細胞收縮功能。為了維持線粒體膜電位的功能,F1FOATP酶活性增加,線粒體內磷酸化增強,使殘留ATP逐漸分解利用,ATP減少會加重缺氧導致的心肌細胞收縮功能損害。缺氧將導致心肌細胞氧化磷酸化中斷,無氧糖酵解啟動,乳酸堆積, 使細胞內PH下降至7.0以下。細胞無氧代謝產物堆積將激活Na+-H+離子交換體,促使細胞內Na+超負荷。作為對Na+超負荷的代償反應,Na+-Ca2+離子交換體激活,鈣離子內流,導致心肌細胞鈣超載(鈣離子超負荷),進而激活內質網應激。心肌細胞凋亡和心肌纖維化是導致心室重構和心功能不全的重要原因。心肌梗死時,破壞的心肌組織為纖維瘢痕組織取代。由于纖維瘢痕組織沒有舒縮能力,左心室舒縮功能受損,最終進展為慢性心力衰竭。而另一方面,心肌缺血導致心肌細胞凋亡,左心室收縮功能受損,如果心肌缺血持續(xù)得不到糾正,最終導致慢性心力衰竭。心肌細胞凋亡和心肌纖維化將促進左心室重構,左心室的病理表現(xiàn)是左心室梗死區(qū)域變薄,心室內腔擴大和收縮舒張功能受損。而心室重構與血流動力學狀態(tài)異常密切相關,長期得不到糾正將導致慢性心力衰竭。大量研究表明ERS與心肌細胞凋亡和心肌纖維化有密切關系。當心臟遭受壓力負荷、缺血／再灌注損傷或心肌梗死時,ERS加重,CHOP表達上調,進而導致心肌細胞凋亡、心室重構、心肌纖維化和心功能不全。大量研究表明通過藥物干預或遺傳學手段敲除(或敲低)CHOP可減輕內質網應激,抑制心肌細胞凋亡和炎癥反應,改善壓力負荷小鼠心室重構和減輕小鼠心臟缺血／再灌注損傷。然而,敲除CHOP在永久心肌梗死中的作用尚不明確。上述研究分析提示敲除CHOP可能在心肌梗死后心室重構中發(fā)揮重要作用。本課題旨在驗證敲除CHOP在心肌梗死后心室重構中的作用及其機制,為臨床上沒有條件或者錯過接受再灌注治療的心肌梗死患者提供新的治療手段。研究方法1.心肌梗死模型的建立8-12周齡,體重20-25g的CHOP基因敲除小鼠和野生型雄性小鼠,甲苯噻嗪(5mg/kg)和氯胺酮(100mg/kg)混合腹腔注射麻醉。經胸骨左側第四肋間開胸,暴露心臟。以8-0絲線穿過左心耳下緣1-2mm處的2/3心肌層,永久結扎左側冠狀動脈。手術過程中一直進行心電監(jiān)護,以心電圖ST段抬高和心肌變白為判斷心肌梗死成功的標準,心肌梗死成功后關閉胸腔,使心肌永久缺血28天。假手術的制作過程相似但無需結扎冠狀動脈。2.心肌缺血/再灌注模型建立8-12周齡,體重20-25g的CHOP基因敲除小鼠和野生型雄性小鼠,甲苯噻嗪(5mg/kg)和氯胺酮(100mg/kg)混合腹腔注射麻醉。經胸骨左側第四肋間開胸,暴露心臟。以8-0絲線帶針線穿過左心耳下緣1-2mm處的2/3心肌層,針尾套入珠子后短暫結扎左側冠狀動脈誘導心肌缺血45分鐘后解除結扎使其再灌注7天。手術過程中一直進行心電監(jiān)護,心電圖ST段視作缺血成功的標志,去除珠子后ST段下降視作再灌注成功標志。假手術僅需套入珠子而無需結扎冠狀動脈。3.生存分析用8-12周齡,體重20-25g的CHOP基因敲除小鼠和野生型雄性小鼠制作心肌梗死模型,實驗分為4組：野生型+假手術組、野生型+心肌梗死組、基因敲除+假手術組以及基因敲除+心肌梗死組。觀察和記錄4周內小鼠的生存率和死亡原因。4.心肌梗死面積測量為評價敲除CHOP對心肌梗死小鼠心肌梗死程度的影響,我們于心肌梗死術后3-12小時內戊巴比妥鈉過量麻醉脫臼處死小鼠,心臟取材,-20℃冰凍后切片做TTC染色測量心肌梗死面積。實驗分為野生型+心肌梗死組、基因敲出+心肌梗死組。被紅染的部分為正常組織,白色部分為壞死組織,心肌梗死面積(%)=梗死區(qū)域面積／左心室面積×100%。5.超聲心動圖檢查小鼠心梗模型制備4周后用心臟超聲儀測量左室內徑和功能,分為野生型+假手術組、野生型+心肌梗死組、基因敲除+假手術組、基因敲除+心肌梗死組。清醒狀態(tài)下固定小鼠,左側胸部脫毛后,二維超聲定位,M超測量舒張期左室前后壁厚度(LVAWd和LVPWd),左室舒張末內徑(LVEDd)和左室收縮末內徑(LVESd),進而測量左室縮短分數(shù)(LVFS)和左室射血分數(shù)(LVEF):LVFS (%)=(LVEDd—LVESd)/LVEDd×100%,LVEF (％)=[(LVEDV-LVSv)/ LVEDc]×100%.超聲檢查后,將小鼠以0.5%戊巴比妥鈉過量(100mg/kg)麻醉頸椎脫臼處死,稱量心臟重量和肺重量以計算心重體重比和肺重體重比。6.創(chuàng)傷性左室血流動力學檢查小鼠心梗模型制備4周后檢測小鼠左室血流動力學指標,實驗分為野生型+假手術組、野生型+心肌梗死組、基因敲除+假手術組、基因敲除+心肌梗死組。甲苯噻嗪和氯胺酮復合麻醉,氣管插管,機械通氣。顯微鏡下右側頸總動脈置入米勒導管(Millar導管),輕輕送入左心室,測量心率(HR),左室收縮壓(LVSP),左室舒張末壓(LVEDP),并通過PowerLab軟件程序計算左室壓力最大、最小變化率(dp/dt max,dp/dt min)和指數(shù)的弛豫時間常數(shù)(τ)。7.TUNEL染色和Masson染色我們通過TUNEL染色和Masson染色評價敲除CHOP對心肌細胞凋亡和心肌纖維化的影響,實驗分為野生型+心肌梗死組、基因敲出+心肌梗死組、野生型+缺血／再灌注組、基因敲出+缺血／再灌注組。其中小鼠心肌梗死4周,缺血／再灌注7天過量麻醉脫臼處死取材,4%多聚甲醛固定固定后石蠟包埋切片后做TUNEL染色和Masson染色。8.統(tǒng)計學分析SPSS16.0測量統(tǒng)計顯著性差異,計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤(mean±SE)表示。三組以上的統(tǒng)計學差異用ANOVA檢驗,組間差異用Bonferroni氏法校正。整體生存狀況用Kaplan-Meier生存分析,組間比較用對數(shù)秩檢驗。P0.05代表具有統(tǒng)計學意義。結果1.敲除CHOP增加小鼠心肌梗死死亡率選取經過基因鑒定的8-10周齡,雄性,體重約20-25 g的CHOP基因敲除小鼠及其野生型小鼠制作心肌梗死模型。模型制作成功后每天觀察2次,早晚各1次,及時發(fā)現(xiàn)死亡小鼠并行尸檢確定死亡原因,詳細記錄和統(tǒng)計分析小鼠的生存情況和死亡原因。心肌梗死4周CHOP基因敲除小鼠心梗死亡率顯著高于野生型小鼠(68% vs 38.5%,P0.05),說明敲除CHOP增加小鼠永久性心肌梗死死亡率。2.敲除CHOP對小鼠心肌梗死面積沒有影響敲除CHOP會增加小鼠心肌梗死死亡率,那么敲除CHOP對心肌梗死程度的影響如何呢?我們選取經過基因鑒定的8-10周齡,雄性,體重約20-25 g的CHOP基因敲除小鼠及其野生型小鼠制作心肌梗死模型。模型制作成功后3-12小時內0.5%戊巴比妥鈉過量麻醉脫臼處死小鼠,摘取心臟-20℃冷凍后切片行TTC染色測量心肌梗死面積。研究發(fā)現(xiàn)敲除CHOP基因敲除小鼠與其野生型小鼠的心肌梗死面積相似(45.7% vs 47.3%,P=0.54),說明敲除CHOP不能減小小鼠心肌梗死面積。3.敲除CHOP對小鼠心肌梗死心室重構和心功能沒有影響既然敲除CHOP對小鼠心梗面積沒有影響,那么敲除CHOP對心肌梗死后心室重構和心功能有什么影響呢?我們選取心肌梗死后4周的小鼠進行超聲心動圖檢查評價心室重構程度和心功能。處死小鼠稱取心肺重量評價永久性心肌梗死對心肺形態(tài)的影響。結果表明心肌梗死4周,CHOP敲除基因鼠與野生型小鼠相比較,除了左室前壁厚度(LVAWd)顯著增厚之外,左室后壁厚度(LVPWd)、左心室舒張末直徑(LVEDd)和左室收縮末內徑(LVEDs)二組之間沒有統(tǒng)計學差異。左心室收縮功能方面,左室縮短分數(shù)(LVFS)和左室射血分數(shù)(LVEF)兩組間也沒有統(tǒng)計學差異。而與接受假手術的小鼠相比,CHOP敲除基因鼠和野生型小鼠有相似的改變：左心室顯著擴大(LVESd和LVEDd增加),LVFS和LVEF顯著下降。而另一方面,無論CHOP敲除組還是野生型組小鼠心肌梗死對心肺重量沒有顯著影響。這些結果說明敲除CHOP不能改善心肌梗死后心室重構和心功能。4.敲除CHOP對小鼠心肌梗死左心室血流動力學沒有影響超聲水平驗證敲除CHOP對心肌梗死心室重構和心功能的影響后我們接著驗證敲除CHOP對小鼠心肌梗死血流動力學的影響。同樣,我們選取心梗模型后4周小鼠行有創(chuàng)血流動力學檢查。置入millar導管后連接Powlaber系統(tǒng)測量血流動力學指標。結果表明與接受假手術的小鼠相比,接受心肌梗死手術4周的小鼠,無論左室收縮壓(LVSP)、左室壓力最大、最小變化率(dp/dt max, dp/dt min)、左室收縮力(contractility)以及左室舒張末壓力(LVEDP)指數(shù)弛豫時間常數(shù)(τ)顯著下降,然而CHOP基因敲除組與野生型組之間并沒有統(tǒng)計學差異。這些結果表明敲除CHOP不能改善心肌梗死后左心室血流動力學狀態(tài)。5.敲除CHOP對小鼠心肌梗死心肌細胞凋亡水平和心肌纖維化程度沒有影響上述結果表明敲除CHOP對小鼠心肌梗死后心臟形態(tài)學和功能學都沒有影響,接下來我們在組織學水平驗證CHOP對小鼠心肌梗死的影響。小鼠心肌梗死4周心臟取材固定、石蠟包埋切片后做TUNEL染色和Masson染色檢測心肌細胞凋亡和心肌纖維化。結果顯示心肌梗死4周,CHOP敲除小鼠和野生型小鼠的心肌梗死區(qū)被纖維瘢痕組織取代,兩組的陳舊心梗面積(纖維化)和交界區(qū)心肌纖維化程度沒有顯著差異,CHOP敲除小鼠心肌細胞凋亡較野生型小鼠無顯著差異。6.敲除CHOP對小鼠心肌缺血/再灌注心肌梗死面積、心肌細胞凋亡和心肌纖維化的影響上述研究表明敲除CHOP增加永久性心肌梗死的死亡率,不能減輕心室重構和心功能損害,而大量文獻報道敲除或下調CHOP表達對小鼠心肌缺血／再灌注損傷有利。有鑒于此,我們進一步研究了敲除CHOP對小鼠心肌缺血/再灌注損傷的影響。心肌缺血45分鐘,再灌注24小時處死小鼠做心臟TTC染色測量心肌梗死面積；心肌缺血45分鐘,再灌注7天處死小鼠心臟組織切片做TUNEL染色和Masson染色。我們發(fā)現(xiàn)CHOP敲除組(KO)心梗面積較野生型小鼠(WT)顯著減小,有統(tǒng)計學差異(29.83% VS 17.34%,P0.05)；敲除CHOP也能顯著減輕小鼠缺血／再灌注損傷心肌纖維化(23.0% VS 16.0%,P0.05)和心肌細胞凋亡(0.84% VS 0.56%,P0.05),有統(tǒng)計學差異。這些結果說明敲除CHOP能減輕小鼠心肌缺血/再灌注損傷。結論盡管抑制CHOP有抗心肌細胞凋亡和抗心肌纖維化的作用,然而敲除CHOP一方面增加永久性心肌梗死心臟破裂發(fā)生率且不能改善心肌梗死后心室重構,另一方面可以減輕心肌再灌注損傷。說明再灌注治療是敲除CHOP使心肌梗死獲益的先決條件。
【關鍵詞】：C/EBP內源性蛋白(CHOP) 心肌梗死 缺血/再灌注 內質網應激 心力衰竭
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R542.22
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 前言20-22
• 實驗方法22-39
• 一、實驗動物及材料22-25
• 二、實驗方法和實驗方案25-39
• 結果39-47
• 1 敲除CHOP對小鼠心肌梗死的影響39-44
• 2 敲除CHOP對小鼠心肌缺血/再灌注的影響44-47
• 討論47-51
• 結論51-52
• 參考文獻52-60
• 英文縮略詞60-61
• 研究成果61-62
• 成果62-63
• 致謝63-65

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