本文關(guān)鍵詞：氧化型低密度脂蛋白協(xié)同機械牽張力對巨噬細胞ROS的誘導(dǎo)與機制探討

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【摘要】：目的:動脈粥樣斑塊病變的重要成分泡沫細胞主要有兩種來源:血管平滑肌細胞和巨噬細胞。前期我們已經(jīng)證實,高血壓產(chǎn)生的機械牽張力(SS)和/或高血糖產(chǎn)生的晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)可激活血管平滑肌細胞的絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號通路和活性氧(ROS)氧化應(yīng)激通路;SS和/或氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)可激活巨噬細胞ERK1/2信號通路.但是SS和/或oxLDL對巨噬細胞的ROS氧化應(yīng)激通路的影響尚不清楚;這兩種致病因素對巨噬細胞ROS的產(chǎn)生與ROS氧化應(yīng)激通路的上游分子,NADPH氧化酶(主要是Nox1)的關(guān)系尚不清楚;前期有報道稱動脈粥樣硬化的常用調(diào)血脂藥辛伐他汀可減緩血管重塑的進展,此作用與巨噬細胞的氧化應(yīng)激的關(guān)系及其具體機制亦尚不清楚。以上是本課題主要關(guān)注的問題,為進一步補充發(fā)展本課題組之前提出的“高血壓機械力非特異性激活多條信號通路”的學(xué)說,深入SS和oxLDL引起血管重構(gòu)的機制探討、臨床尋找防治高血壓或合并高血脂患者的新靶點提供實驗資料。實驗方法:(1)從ATCC購得巨噬細胞RAW264.7,用DMEM高糖培養(yǎng)基及濃度為10%的標準胎牛血清培養(yǎng)。待細胞長滿,使用塑料細胞刮傳代。(2)從人血漿中提取的低密度脂蛋白(LDL),同氧化后形成的oxLDL,用外觀顏色和瓊脂糖電泳相鑒別。將細胞以2×104的密度接種于六孔板上,待細胞生長至80%融合時,換用無血清的培養(yǎng)基饑餓處理12小時后,按照實驗要求施加不同處理因素。(3)用Hoechst 33342染料標記產(chǎn)生ROS的巨噬細胞的細胞核,檢測細胞核被標記的數(shù)目;采用H2DCFDA熒光探針,檢測oxLDL或/和SS作用下巨噬細胞ROS的產(chǎn)生情況。(4)應(yīng)用NADPH氧化酶抑制劑(羅布麻寧/apocynin)預(yù)處理巨噬細胞后,施加不同處理因素,重復(fù)(3)實驗步驟。(5)應(yīng)用辛伐他汀預(yù)處理巨噬細胞后,施加不同處理因素,重復(fù)(3)實驗步驟。(6)應(yīng)用辛伐他汀預(yù)處理后,通過Western Blot檢測SS介導(dǎo)的巨噬細胞Nox1的表達。(7)應(yīng)用辛伐他汀預(yù)處理后,通過Western Blot檢測SS和oxLDL單獨或聯(lián)合介導(dǎo)的巨噬細胞MAPKs的表達。結(jié)果:(1)采用ATCC購買的巨噬細胞RAW264.7細胞系,細胞呈圓形,胞核位于中央,半貼壁生長。(2)LDL液體呈均一淡黃色,通透且無沉淀;氧化后呈乳白色,無沉淀。(3)oxLDL和SS單獨作用均可以誘導(dǎo)巨噬細胞RAW264.7 ROS水平升高,并呈現(xiàn)時間或濃度(強度)依賴性。(4)oxLDL和SS聯(lián)合作用可促進巨噬細胞RAW264.7 ROS水平進一步升高,高于任一單獨因素的作用,呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。(5)應(yīng)用Nox1抑制劑預(yù)處理后,oxLDL或/和SS誘導(dǎo)的ROS生成減少。表明oxLDL和SS所引起的巨噬細胞RAW264.7 ROS的產(chǎn)生與Nox1的激活有關(guān)。(6)辛伐他汀預(yù)處理后,oxLDL或/和SS介導(dǎo)的ROS生成減少,并且隨著辛伐他汀濃度增高,其抑制巨噬細胞RAW264.7ROS產(chǎn)生的作用越顯著。(7)辛伐他汀可以抑制oxLDL或/和SS介導(dǎo)的小鼠巨噬細胞RAW264.7 MAPKs的表達。結(jié)論:(1)oxLDL和SS可分別誘導(dǎo)巨噬細胞ROS水平升高,而兩者聯(lián)合刺激可促進胞內(nèi)ROS水平的進一步升高,呈協(xié)同效應(yīng),導(dǎo)致ROS大量蓄積而觸發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng),參與并加速血管重構(gòu)。而此過程中所生成的ROS部分來源于Nox1的激活。(2)辛伐他汀參與調(diào)控oxLDL或SS作用下巨噬細胞Nox1的激活,導(dǎo)致了ROS水平的降低。并且,辛伐他汀可以抑制oxLDL或/和SS介導(dǎo)的小鼠巨噬細胞RAW264.7 MAPKs的表達。(3)本課題初步探究了高血脂oxLDL與高血壓SS單獨和聯(lián)合作用下誘導(dǎo)巨噬細胞ROS生成的分子機制,并且進一步補充發(fā)展了我們先前提出的“高血壓機械力非特異性激活多條信號通路”的學(xué)說,為深入高血壓SS以及高血脂oxLDL引起血管重構(gòu)的機制探討以及臨床中尋找防治高血壓或合并高血脂患者的新靶點提供實驗依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：氧化型低密度脂蛋白 機械牽張力 巨噬細胞 活性氧 NADPH氧化酶 辛伐他汀 高血壓 高血脂 血管重構(gòu)
【學(xué)位授予單位】：中山大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R543
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-12
• 前言12-20
• 第1章 巨噬細胞的培養(yǎng)20-25
• 1.1 材料20-21
• 1.2 方法21-23
• 1.3 結(jié)果23
• 1.4 討論23-25
• 第2章 oxLDL的制備與鑒定25-32
• 2.1 材料25-27
• 2.2 方法27-29
• 2.3 結(jié)果29-30
• 2.4 討論30-32
• 第3章 SS與oxLDL單獨/聯(lián)合刺激對巨噬細胞ROS產(chǎn)生的影響32-43
• 3.1 材料33-34
• 3.2 方法34-36
• 3.3 結(jié)果36-42
• 3.4 討論42-43
• 第4章 SS、oxLDL單獨/聯(lián)合刺激介導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生的ROS源于Nox1的激活43-52
• 4.1 材料44-45
• 4.2 方法45-46
• 4.3 結(jié)果46-51
• 4.4 討論51-52
• 第5章 辛伐他汀對SS、oxLDL刺激介導(dǎo)小鼠巨噬細胞RAW264.7 產(chǎn)生ROS的影響52-61
• 5.1 材料52-54
• 5.2 方法54-55
• 5.3 結(jié)果55-60
• 5.4 討論60-61
• 第6章 辛伐他汀抑制SS和/或oxLDL引起的巨噬細胞RAW264.7MAPKs磷酸化61-69
• 6.1 材料61-62
• 6.2 實驗方法62-65
• 6.3 結(jié)果65-67
• 6.4 討論67-69
• 結(jié)論69
• 創(chuàng)新性69-70
• 參考文獻70-78
• 在校期間的科研成果78
• 基金項目支持78-79
• 主要英文縮寫詞匯表79-80
• 致謝80

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本文編號：1079350