本文關(guān)鍵詞：血小板活化功能及血小板微粒對(duì)重型血友病A臨床表現(xiàn)異質(zhì)性影響的研究

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【摘要】：背景和目的血友病A是一種較罕見(jiàn)的X染色體連鎖的隱性遺傳性出血性疾病,據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)和世界血友病聯(lián)盟(WFH)調(diào)查,血友病A的發(fā)病率約為1/10000,其中重型血友病A的發(fā)病率約為1/16000,全球中重型血友病患者共350000人，，我國(guó)估計(jì)病例10-13萬(wàn)人。血友病A的發(fā)病基礎(chǔ)是凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因缺陷導(dǎo)致的Ⅷ因子水平(FⅧ:C)和(或)功能減低而使血液不能正常凝固,其主要的臨床表現(xiàn)為自發(fā)性關(guān)節(jié)和組織出血,以及出血引起的畸形。目前我國(guó)主要根據(jù)血漿中FⅧ/FIX活性值進(jìn)行臨床分型,分為亞臨床型、輕型、中型和重型,因輕中型病例漏診率高,統(tǒng)計(jì)顯示重型患者高達(dá)60-70%[21。在未經(jīng)治療的情況下,重型血友病患者平均每月可發(fā)生1-6次自發(fā)性關(guān)節(jié)、肌肉及軟組織出血,反復(fù)的關(guān)節(jié)出血引起的關(guān)節(jié)滑膜炎、軟骨破壞、骨性關(guān)節(jié)炎、肌肉萎縮等病變使關(guān)節(jié)功能喪失而致殘,而且慢性血友病關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)障礙降低了患者的生活質(zhì)量,除血友病性關(guān)節(jié)病外,骨筋膜室綜合征、假性腫瘤、重要臟器出血等為血友病患者常見(jiàn)的危險(xiǎn)并發(fā)癥。血友病的出血頻率及嚴(yán)重程度往往與其凝血因子水平相關(guān),患者出血時(shí)的治療目前仍為外源性凝血因子替代治療為主,維持足夠時(shí)間的預(yù)防治療和盡早、足量的按需治療成為阻止關(guān)節(jié)殘疾進(jìn)展的主要策略。反復(fù)的出血事件及并發(fā)癥的治療給患者帶來(lái)了極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。醫(yī)療條件、經(jīng)濟(jì)承受能力、藥物來(lái)源等問(wèn)題是制約治療水平的主要因素。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)及我們的前期工作均發(fā)現(xiàn),即使是血漿凝血因子水平相同的患者,其出血的嚴(yán)重程度及出血頻率、外源性凝血因子需求也可能存在顯著的差異,通過(guò)監(jiān)測(cè)患者出血事件的頻率或凝血因子輸注情況,約10-15%的重型血友病A患者僅表現(xiàn)為輕度出血(年出血≤6次/年),國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道中van Dijk,K等也發(fā)現(xiàn),如果不經(jīng)治療,有些病人年出血事件可達(dá)96次,而另外一些人則很少出血,這種現(xiàn)象被稱為重型血友病的臨床表現(xiàn)異質(zhì)性.我們前期工作也已經(jīng)證實(shí)了存在異質(zhì)性的現(xiàn)象,李含[4]通過(guò)分析223例重型患者的資料發(fā)現(xiàn)：我國(guó)華南地區(qū)重型血友病A患者臨床表現(xiàn)具有明顯的異質(zhì)性,輕度表型占12.9%；15歲以上無(wú)關(guān)節(jié)畸形者約9.3%。這種臨床表現(xiàn)異質(zhì)性的機(jī)制至今尚不明確,血友病雖為單基因突變的遺傳性疾病,但其臨床表現(xiàn)是遺傳和環(huán)境等多種因素共同影響的結(jié)果,僅是基因表型不能解釋重型患者輕度出血表型的現(xiàn)象。在Santagostino等的研究中,通過(guò)凝血酶生成試驗(yàn)檢測(cè)重型血友病患者血漿促凝及抗凝活性,證實(shí)重型患者臨床表現(xiàn)異質(zhì)性與促凝及抗凝活性差異相關(guān),提示FⅧ活性不是衡量臨床分型的唯一因素,也表明血漿凝血因子水平并不能完全準(zhǔn)確衡量和預(yù)測(cè)患者的出血風(fēng)險(xiǎn)、治療需求和長(zhǎng)期預(yù)后,其它可能還存在的對(duì)臨床表現(xiàn)產(chǎn)生影響的因素值得我們探究。結(jié)合國(guó)內(nèi)外已有研究結(jié)果和我們先前的工作發(fā)現(xiàn),影響重型血友病A臨床表現(xiàn)異質(zhì)性可能是(1)FⅧ基因突變類型；(2)促凝與抗凝蛋白的活性相關(guān)的因素(如FⅧ藥代動(dòng)力學(xué)、vWFAg水平、纖溶酶原活性)； (3)出血癥狀有關(guān)因素(如首次出血年齡、首次關(guān)節(jié)出血年齡、靶關(guān)節(jié)數(shù)目、關(guān)節(jié)功能狀況)；(4)其他因素(如體力活動(dòng)水平、身體質(zhì)量指數(shù)、血管活性、心理狀態(tài)等)相關(guān)。正常的凝血過(guò)程中,血小板起著至關(guān)重要的作用。國(guó)外Beatrice Cambien等認(rèn)為P-選擇素能通過(guò)促進(jìn)血小板聚集,纖維蛋白的形成從而促進(jìn)止血。VanBladel等發(fā)現(xiàn)輕中型血友病A患者的血小板活性較重型患者的明顯升高。血小板活化后質(zhì)膜翻轉(zhuǎn)形成血小板微粒,膜磷脂表面暴露,提供大量凝血因子結(jié)合表位,促進(jìn)凝血酶生成從而促凝血。血小板微粒作為活化后的產(chǎn)物,在局部擴(kuò)大了活化反應(yīng)并將信息向遠(yuǎn)處傳遞,增加遠(yuǎn)處血小板活化水平。HrachovinovaI等在小鼠上證實(shí)P-選擇素與其配體PSGL-1相互作用而促進(jìn)微粒的產(chǎn)生[9]。結(jié)合國(guó)外在其它領(lǐng)域多證實(shí)MPs促凝作用的事實(shí),我們假設(shè)重型患者血小板活化水平、PMPs水平存在差異,這種差異可能通過(guò)影響凝血過(guò)程而對(duì)重型血友病A患者臨床表現(xiàn)產(chǎn)生影響。我們的前期工作篩選分析了廣東省血友病病例信息管理中心登記223例重型血友病A患者的出血情況,發(fā)現(xiàn)在重型患者中臨床表現(xiàn)確實(shí)存在異質(zhì)性。本實(shí)驗(yàn)擬研究臨床表現(xiàn)存在異質(zhì)性的兩組重型血友病A患者(重型血友病A輕度表型組和重型血友病A重度表型組)不同狀態(tài)下血小板活化功能及血小板源性微粒(PMPs)數(shù)目的變化,探討P-選擇素、MPs與臨床表現(xiàn)異質(zhì)性的關(guān)系及其機(jī)制,為明確重型血友病A患者臨床表現(xiàn)異質(zhì)性形成原因、完善個(gè)體化治療決策提供依據(jù),也可能拓展血友病非凝血因子治療的新途徑。方法一、流式細(xì)胞術(shù)血小板活化功能檢測(cè)：1.1病例資料：根據(jù)Bethil TC分型方案,以FⅧ活性(FⅧ:C)2%界定重型血友病A患者,2012年2月至2014年4月間,從廣東省血友病病例信息管理中心篩選登記的有完整病史資料的367例患者中,選取符合年齡大于18歲、因子替代治療方案均為按需治療,試驗(yàn)前72小時(shí)內(nèi)無(wú)出血事件、無(wú)用藥記錄,排除FⅧ抑制物陽(yáng)性(Bethesda法0.6BU)患者及合并其他基礎(chǔ)疾病的重型血友病A患者。經(jīng)知情告知,有31名患者符合要求并自愿加入本項(xiàng)研究,另招募有17名健康男性志愿者自愿加入本試驗(yàn),均簽署知情同意書(shū)。根據(jù)患者自發(fā)性出血頻率,分別以出血頻率6次／年、24次／年為分界點(diǎn),定義近2年來(lái)患者自發(fā)性年出血頻率≤6次／年為重型血友病輕度表型,24次／年為重型血友病重度表型[4],其中輕度表型10人,重度表型21人,健康成年男性志愿者17人為正常對(duì)照。各組年齡、體重均匹配。受試者BMI在正常范圍。1.2主要儀器與試劑：1.2.1主要儀器：Thermo高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)(CantoII,美國(guó)Becton Diekson公司),血液細(xì)胞XE-2100M分析流水系統(tǒng)(SYSMEX,上海)。1.2.2主要試劑：Mouse IgG1-PE(美國(guó)Becton Diekson公司)、CD41a-APC(美國(guó)Becton Diekson公司)、CD42b-PE(美國(guó)Becton Diekson公司)、CD61-FITC(美國(guó)Becton Diekson公司)、CD62P-PE(美國(guó)Becton Diekson公司)、CD63-PE(美國(guó)Becton Diekson公司)、1%多聚甲醛、PBS磷酸鹽緩沖液(本院自配)。1.2.3其他：Falocn上樣管(美國(guó)Becton Diekson公司),微量移液器(德國(guó)eppendorf)、真空采血器、0.109mol/L枸櫞酸鈉抗凝管,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管,一次性采血針。1.3實(shí)驗(yàn)步驟與方法：采用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)檢測(cè)富血小板血漿(PRP)中血小板膜表面CD62P、CD63日性率。1.3.1標(biāo)本處理：患者經(jīng)過(guò)大于72小時(shí)的洗脫期(試驗(yàn)前72小時(shí)內(nèi)無(wú)出血事件、無(wú)用藥記錄)后進(jìn)行采血,按照靜脈采血指南采集吲,清晨空腹,使用大于20號(hào)針頭一次性采血針采集肘前靜脈的靜脈血,為避免造成額外血小板活化采血過(guò)程中禁止使用止血帶,將采血針插入EDTA抗凝管中,前2mL靜脈血用于血小板計(jì)數(shù)檢測(cè),繼續(xù)采集將2.7 mL靜脈血沿試管壁緩慢注入0.109mol/L枸櫞酸鈉抗凝管(藍(lán)色帽管),避免血樣起泡,血液與抗凝劑比例為9：1。30分鐘內(nèi)處理血樣,先將血樣800rpm離心5分鐘,吸取上層血漿,得到富血小板血漿(PRP)后血樣按照下表加樣處理。按照表1-1加樣。1.3.2單克隆熒光抗體標(biāo)記每個(gè)樣本分別取4只上樣管,如上分別加入熒光標(biāo)記的同型單抗IgG1、CD61、 CD62P、CD63單克隆抗體,輕輕混勻,室溫下避光孵育20分鐘,使抗體與細(xì)胞表面標(biāo)記充分結(jié)合,20分鐘后加入5mL的pH7.4PBS,3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘,除去多余的未結(jié)合的單克隆熒光抗體,加入1%多聚甲醛0.5mL進(jìn)行稀釋,即刻上機(jī)檢驗(yàn)。二、流式細(xì)胞術(shù)血小板源性微粒(PMPs)檢測(cè)：2.1研究對(duì)象：根據(jù)Bethil TC分型方案,以FⅧ活性(FⅧ:C)2%界定重型血友病A患者,2012年2月至2014年4月間,從廣東省血友病病例信息管理中心篩選登記的有完整病史資料的367例患者中,選取符合年齡大于18歲、因子替代治療方案均為按需治療,試驗(yàn)前72小時(shí)內(nèi)無(wú)出血事件、無(wú)用藥記錄,排除FⅧ抑制物陽(yáng)性(Bethesda法0.6BU)患者及合并其他基礎(chǔ)疾病的重型血友病A患者。經(jīng)知情告知,有31名患者符合要求并自愿加入本項(xiàng)研究,另招募有17名健康男性志愿者自愿加入本試驗(yàn),均簽署知情同意書(shū)。根據(jù)患者自發(fā)性出血頻率,分別以出血頻率6次/年、24次/年為分界點(diǎn),定義近2年來(lái)患者自發(fā)性年出血頻率≤6次/年為重型血友病輕度表型,24次/年為重型血友病重度表型[4],其中輕度表型10人,重度表型21人,健康成年男性志愿者17人為正常對(duì)照。各組年齡、體重均匹配。受試者BMI在正常范圍。以上所采集血樣用于血小板微粒檢測(cè)。在重度表型按需治療的患者中,有11人經(jīng)患者同意我們?cè)谄浠�狀態(tài)、急性出血期、Ⅷ因子注射治療后進(jìn)行了靜脈血采集PMPs檢測(cè)�；�狀態(tài)的標(biāo)本采集符合72小時(shí)內(nèi)無(wú)出血事件、無(wú)用藥記錄；急性出血期采血限制在出血事件發(fā)生后1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行且采血前未使用凝血因子；Ⅷ因子注射(劑量15IU/kg)治療采血在因子直射后8-12小時(shí)進(jìn)行。通過(guò)比較受試者基線狀態(tài)、急性出血期、因子治療后PMPs的水平了解重度表型患者不同時(shí)期外周血PMPs水平及因子替代治療對(duì)PMPs水平的影響。2.2主要儀器與試劑：2.2.1主要儀器：Thermo高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)(CantoII,美國(guó)Becton Diekson公司),THC-Z恒溫振蕩器(中國(guó)江蘇太倉(cāng)試驗(yàn)儀器廠)。2.2.2主要試劑：Mouse IgG1-PE(美國(guó)Becton Diekson公司)、CD41-FITC(美國(guó)Becton Diekson公司)、CD62P-PE(美國(guó)Becton Diekson公司)、CD63-PE(美國(guó)Becton Diekson公司)、1μm標(biāo)準(zhǔn)熒光微珠(Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品,香港大學(xué)贈(zèng)送)。1%多聚甲醛、PBS磷酸鹽緩沖液(本院自配)。2.2.3其他：Falocn上樣管(美國(guó)Becton Diekson公司),微量移液器(德國(guó)eppendorf)、真空采血器、0.109mol/L枸櫞酸鈉抗凝管,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管,一次性采血針。2.3實(shí)驗(yàn)原理與步驟：2.3.1方法：患者經(jīng)過(guò)大于72小時(shí)的洗脫期(試驗(yàn)前72小時(shí)內(nèi)無(wú)出血事件、無(wú)用藥記錄)后進(jìn)行采血,按照靜脈指南采集,清晨空腹,使用大于20號(hào)針頭一次性采血針采集肘前靜脈的靜脈血,為避免造成額外血小板活化采血過(guò)程中禁止使用止血帶,將采血針插入EDTA抗凝管中,前2mL靜脈血用于血小板計(jì)數(shù)檢測(cè),繼續(xù)采集將2.7 mL靜脈血沿試管壁緩慢注入0.109mol/L枸櫞酸鈉抗凝管(藍(lán)色帽管),避免血樣起泡,血液與抗凝劑比例為9：1。30分鐘內(nèi)處理血樣,先將血樣800rpm離心5分鐘,吸取上層血漿,得到富血小板血漿(PRP)后,將富血小板血漿進(jìn)行高速離心,1550g 20℃離心20分鐘,充分去除血小板,留取上清液,1 8000g 20℃離心30分鐘取上清。凍存于-80℃,后續(xù)統(tǒng)一流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行微粒檢測(cè)。上述實(shí)驗(yàn)過(guò)程所得標(biāo)本37℃迅速?gòu)?fù)溫,血小板特異性熒光抗體CD41-FITC標(biāo)記PMPs,以標(biāo)準(zhǔn)微球進(jìn)行定位對(duì)照和設(shè)置機(jī)器檢測(cè)條件,調(diào)節(jié)機(jī)器閾值,設(shè)門(mén)計(jì)數(shù)并以PMPs占um CD41日性顆粒的百分比,檢測(cè)靜息狀態(tài)下重型血友病不同臨床表型患者與正常對(duì)照組PMPs水平、連續(xù)低劑量FⅧ預(yù)防治療的重度表型患者基線期、急性出血期及治療3月后PMPs水平。按照表2-1加樣。加樣后用室溫避光孵育30分鐘,使熒光單抗與血小板微粒特異性結(jié)合,檢測(cè)前用PBS溶液將容積調(diào)整至0.5mL。上機(jī)檢測(cè)：裝滿并檢查鞘液桶,棄廢液,打開(kāi)FCM,儀器氣路加壓,排空氣泡,校準(zhǔn)儀器光路使之處于最佳狀態(tài),變異系數(shù)2%,建立前向角光散射對(duì)側(cè)向角光散射雙對(duì)數(shù)散點(diǎn)圖(FSC LOG-SSCLOG),以直徑為1μm的標(biāo)準(zhǔn)微球作為定位對(duì)照,根據(jù)定位對(duì)照,將儀器SSC的閾值調(diào)至200,FSC的增益和電壓分別調(diào)至100和1000。在此條件下收集和分析到的信號(hào)均由PMPs和標(biāo)準(zhǔn)微球產(chǎn)生,并在同一條件下測(cè)定一管僅含去離子水的空白對(duì)照以此驗(yàn)證儀器噪音信號(hào)的干擾程度。PMPs流式細(xì)胞儀檢測(cè)和門(mén)的設(shè)定用1μm的標(biāo)準(zhǔn)微球設(shè)定前向檢測(cè)區(qū),使用流式細(xì)胞儀檢鋇PMP CD41-PE的表達(dá)。對(duì)所設(shè)門(mén)內(nèi)(微顆粒直徑在0-1μm)的顆粒進(jìn)行分析(圖2-1),PMPs的界定：直徑范圍在0-1μm,表面標(biāo)記CD41陽(yáng)性。結(jié)果2.1一般病例資料比較：重型血友病重度表型組(n=21)平均年齡(23.5±5.33)歲,輕度表型組(n=10)平均年(28.9-±7.06)歲,正常對(duì)照組(n=17)(31.08±8.11)歲,各組間年齡差異不顯著。重度表型組FⅧ活性(FⅧ：C)為(0.96±0.35)%,輕度表型組FⅧ活性為(1.04±0.24)%,兩組FⅧ活性比較P值=0.304,差別不顯著。2.2各組血小板計(jì)數(shù)的比較：重度表型組(n=21)平均血小板計(jì)數(shù)(292.5±83.69)G幾,輕度表型組(n=10)血小板計(jì)數(shù)(256.3±60.52)G/L,正常對(duì)照組(n=17)血小板計(jì)數(shù)(239.5±50.82)G/L,輕度表型組與正常對(duì)照組間P值0.3519,差別不顯著,重度表型組與正常對(duì)照比較P為0.369,重型血友病不同表型組間比較P=0.6217,差異不顯著。2.3各組血小板CD62P表達(dá)率的比較：重度表型組(n=21)CD62P表達(dá)率均值為(36.2±9.27)%；輕度表型組(n=10)CD62P表達(dá)率均值為：(49±11.81)%正常組(n=17)CD62P表達(dá)率均值為(22.06±10.72)%。正常組與輕度表型均值比較,P值=0,差別非常顯著；正常組與重度表型組比較,P值=0.001,差別非常顯著；兩組臨床表型的重型血友病患者組間比較,P值=0.0408,差別顯著。2.4各組血小板CD63的表達(dá)率的比較：重度表型組CD63表達(dá)(34.82±7.13)%；輕度表型組(51.15±14.3)%；正常組CD63表達(dá)為(19.08±17.05)%。正常組與輕度表型組比較,P值＝0,差別極其顯著；正常組與重度表型組比較,P值=0.04,差別顯著；兩組臨床表型的重型血友病患者組間比較P值0.0044,差別極其顯著。2.5各組基線狀態(tài)PMPs水平的比較：輕度表型組PMPs百分率均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差為(2.06±1.33)%,重度表型組百分率均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差為(0.95±0.64)%；正常組PMPs百分率均數(shù)為(1.06±1.20)%,各組間差異P值為0.02,各組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。2.6重度表型患者不同時(shí)期PMPs水平比較：有11名重度表型患者參與了基線狀態(tài)、急性出血期及FⅧ替代治療后PMPs水平檢測(cè),所得數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。患者PMPs基線水平為(0.85±0.18)%；急性出血期PMPs水平為(6.50±0.51)%；FⅧ替代治療后PMP水平s為(0.45±0.40)%,急性出血期、基線、用藥后PMPs基水平兩兩配對(duì)樣本t檢驗(yàn)P值為0,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異非常顯著。結(jié)論成人重型血友病A輕度表型患者血小板活化標(biāo)志CD62和CD63表達(dá)高于重度表型者,且兩者均高于正常對(duì)照組,差異顯著,提示重型血友病患者血小板活化功能存在代償活化,這種活化水平的差異可能是臨床表型異質(zhì)性的原因之一重型血友病A不同臨床表型患者靜息狀態(tài)PMPs均高于正常人群,而且輕度表型的PMPs計(jì)數(shù)高于重度表型,結(jié)論與不同臨床表型的重型血友病A患者血小板活化狀態(tài)一致,說(shuō)明PMPs同樣參與血友病患者的代償性促凝,是重型患者臨床表現(xiàn)異質(zhì)性的原因之一,血小板微粒水平可能能作為預(yù)測(cè)重型患者臨床表型的指標(biāo)。急性出血期與FⅧ注射后PMPs的變化更說(shuō)明PMPs參與促凝止血功能的重要性。
【關(guān)鍵詞】：血友病A 臨床表現(xiàn)異質(zhì)性 流式細(xì)胞術(shù) P-選擇素 血小板源性微粒
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R554.1
【目錄】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-26
• 前言26-33
• 參考文獻(xiàn)29-33
• 第一章 重型血友病A不同臨床表型患者血小板活化功能的比較分析33-46
• 1 材料與方法35-39
• 2 結(jié)果39-41
• 3 討論41-43
• 4 結(jié)論43
• 參考文獻(xiàn)43-46
• 第二章 重型血友病A不同臨床表型患者血小板微粒檢測(cè)的比較分析46-59
• 1 研究對(duì)象與方法46-49
• 2 結(jié)果49-54
• 3 討論54-56
• 4 結(jié)論56
• 參考文獻(xiàn)56-59
• 全文小結(jié)與展望59-60
• 綜述60-69
• 參考文獻(xiàn)65-69
• 主要縮略詞中英文對(duì)照表69-70
• 攻讀碩士學(xué)位期間撰寫(xiě)的論文70-71
• 致謝71-72

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1013727