本文關(guān)鍵詞：MicroRNA在潰瘍性結(jié)腸炎活動度評估及癌變監(jiān)測應(yīng)用初探

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【摘要】：背景和目的潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis, UC)一種病因尚不十分清楚的慢性非特異性腸道炎癥性疾病,將成為我國消化系統(tǒng)常見病。潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌(Ulcerative colitis related colorectal cancer, UCRCC)為其最主要的并發(fā)癥之一。對UC疾病活動度和癌變及時準(zhǔn)確的評估對改善病人預(yù)后有很大的幫助。目前這方面的評估主要依賴內(nèi)鏡檢查,尚缺乏較理想的實驗室評價指標(biāo)。本研究擬在UC患者和小鼠模型中初步探索MicroRNA(miRNA)在UC活動度評估和癌變監(jiān)測中的應(yīng)用。第一部分UC疾病活動度和癌變監(jiān)測相關(guān)血清miRNAs初探方法實驗分組1.UC疾病活動度相關(guān)：預(yù)試驗-重度組(30例重度UC)vs對照組(30例無疾病對照)：驗證實驗-重度驗證組(64例重度UC)vs輕度驗證組(44例輕度UC)vs對照組(60例無疾病對照)。2.UC癌變監(jiān)測相關(guān)：根據(jù)病程將UC患者分為長病程組(病程≥5年,n=39)vs短病程組(病程5年,n=64)；根據(jù)疾病嚴(yán)重程度再分亞組為重度長病程組(n=24)vs重度短病程組(n=40)、輕度長病程組(n=15)vs輕度短病程組(n=29)。候選miRNAs miR-21,31,126,192,19a,224,155,150。miRNAs篩選1.UC疾病活動度相關(guān)：應(yīng)用qRT-PCR技術(shù),在預(yù)試驗中對8種候選miRNAs進(jìn)行篩選,對差異表達(dá)的miRNAs在驗證實驗中進(jìn)一步驗證。用危險因素分析法對篩選后的miRNA在驗證實驗中檢驗其對疾病活動度評估效力。2.UC癌變監(jiān)測相關(guān)：方法同1,根據(jù)病程分組對候選miRNAs表達(dá)變化進(jìn)行統(tǒng)計分析;在重度和輕度UC患者中分別進(jìn)行亞組分析；對年齡與miR-2、miR-126進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果1.UC疾病活動度相關(guān)：①miR-21在重度驗證組較輕度驗證組和對照組表達(dá)升高,分別為2.19倍,3.14倍(P0.001):miR-21在輕度驗證組較對照組表達(dá)有升高趨勢,為1.44倍(P=0.47)。②miR-126在重度驗證組較輕度驗證組和對照組表達(dá)升高,分別為2.63倍,2.55倍(P0.001)；miR-126在輕度驗證組較對照組表達(dá)無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.52)。③miR-21和miR-126聯(lián)合在(重度驗證組vs對照組)評估中特異性為90.0%,陽性預(yù)測值為84.6%,在(重度驗證組vs輕度驗證組)評估中特異性為82.1%,陽性預(yù)測值為85.7%。2.UC癌變監(jiān)測相關(guān)：①miR-21在長病程組較短病程組表達(dá)升高,為2倍(P0.05)；在重度和輕度UC亞組分析示：其在重度長病程組較重度短病程組表達(dá)升高2.14倍(P0.05),在輕度中相應(yīng)組表達(dá)升高1.82倍(P=0.12)；miR-21血清表達(dá)量同UC患者年齡無顯著相關(guān)性(P=0.266)。②miR-126在長病程組較短病程組表達(dá)呈增高趨勢,為1.68倍(P=0.16)；在重度和輕度UC亞組分析示：其在重度長病程組較重度短病程組表達(dá)升高2.23倍(P0.05),在輕度相應(yīng)組中無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.86)。miR-126血清表達(dá)量同UC患者年齡無顯著相關(guān)性(P=0.233)。結(jié)論1.miR.21和miR-126血清表達(dá)水平同UC疾病活動相關(guān),呈高表達(dá),且miR-21表達(dá)水平隨UC疾病活動度有梯度變化。2.miR-21與miR-126對(重度驗證組vs對照組)和(重度驗證組vs輕度驗證組)的聯(lián)合評估效力具有較高的特異性和陽性預(yù)測值,提示血清miRNAs聯(lián)合使用是潛在反映疾病活動度的理想實驗室指標(biāo)。3.miR-21和miR-126表達(dá)水平同UC病程相關(guān),隨病程呈增高趨勢,結(jié)合2者表達(dá)水平與UC患者年齡無顯著相關(guān)性,提示miR-21及miR-126血清表達(dá)水平可能同UC癌變相關(guān)；亞組分析結(jié)果提示miR-21和miR-126隨病程血清表達(dá)變化在重度UC中更為顯著,進(jìn)一步支持這一可能。第二部分niRNAs及對應(yīng)靶nRNA在小鼠UC和UCRCC模型腸組織表達(dá)關(guān)聯(lián)性和可能作用機(jī)制初探方法實驗分組1.miRN A相關(guān)：對照組(9例正常小鼠)vs炎癥組(10例DSS誘導(dǎo)UC小鼠)vs癌變組(10例DSS/AOM誘導(dǎo)UCRCC小鼠)。2.mRNA相關(guān)：對照組(6例正常小鼠)vs炎癥組(7例DSS誘導(dǎo)UC小鼠)vs癌變組(7例DSS/AOM誘導(dǎo)UCRCC小鼠)。候選miRNAs及靶mRNA:1.miRNA第一部分中差異表達(dá)的血清miRNAs,miR-21和miR-126.2.靶mRNA PDCD4和Rhob(miR-21靶mRNA),NFKBIA(miR-126靶mRNA).miRNAs及miRNA表達(dá)水平檢測應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)分別在對照組、炎癥組、癌變組腸組織中檢測候選miRNAs和靶mRNA表達(dá)變化,并結(jié)合文獻(xiàn)初步探討彼此關(guān)聯(lián)性和在UC. UCRCC發(fā)生發(fā)展中可能作用機(jī)制。結(jié)果1. miRNA相關(guān)：①miR-21在炎癥組、癌變組表達(dá)量較對照組均升高,為9.24.倍(P0.05)和7.24倍(P0.01),在炎癥組和癌變組之間無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.75)。②miR-126在炎癥組、癌變組表達(dá)量較對照組均升高,為6.08倍(p0.05)和6.91倍(P0.05),在炎癥組、癌變組之間無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P=-0.88)；③小鼠腸組織病理切片提示癌變組成瘤且粘膜炎癥較炎癥組明顯減輕。2 mRNA相關(guān)：①miR-21靶mRNA-PDCD4表達(dá)量在對照組較炎癥組表達(dá)降低,為0.60(P=0.14),對照組較癌變組表達(dá)升高,為2.3倍(P0.01),在炎癥組較癌變組表達(dá)升高,為3.83倍(P0.01)。②miR-21靶mRNA-Rhob表達(dá)量在對照組較炎癥組和癌變組呈增高趨勢,分別為1.43倍(P=0.17)和1.51倍(P=0.06),在癌變組較炎癥組無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.77)。③miR-126靶mRNA-NFKBIA表達(dá)量在對照組較炎癥組和癌變組均高表達(dá),分別為17.35倍(P0.001)和19.02倍(P0.001),在癌變組和炎癥組之間無統(tǒng)計學(xué)顯著性差異(P=0.85)。結(jié)論1. miR-21 和 miR-126在小鼠腸組織表達(dá)水平同UC炎癥相關(guān),呈高表達(dá),與人血清中變化趨勢一致。2.miR-21和miR-126在癌變組表達(dá)量較炎癥組均無統(tǒng)計學(xué)差異,結(jié)合病理切片結(jié)果,提示miR-21和miR-126可能同UCRCC相關(guān),呈表達(dá)升高。3. PDCD4在癌變組表達(dá)變化與miR-21相反,結(jié)合其生物效應(yīng),初步提示miR-21可能通過下調(diào)PDCD4抑制細(xì)胞凋亡從而促進(jìn)UCRCC發(fā)生。對于PDCD4在炎癥組表達(dá)上調(diào)這一結(jié)果,仍需進(jìn)一步探究。4.Rhob在癌變組和炎癥組表達(dá)變化同miR-21相反,結(jié)合其生物效應(yīng),初步提示miR-21可能通過下調(diào)Rhob表達(dá),破壞腸組織緊密連接促進(jìn)UC發(fā)生,影響細(xì)胞遷移促進(jìn)UCRCC發(fā)生。5. NFKBIA在癌變組與炎癥組中表達(dá)變化同miR-126相反,結(jié)合其生物效應(yīng),初步提示miR-126可能通過下調(diào)NFKBIA,激活NF-κB通路介導(dǎo)UC和UCRCC的發(fā)生。全文總結(jié)1. miR-21、miR-126血清和腸組織表達(dá)變化可能對UC疾病活動和癌變具有提示作用。2.血清niRNAs聯(lián)合檢測可能是潛在的反映疾病活動度的理想實驗室指標(biāo)。3. miR-21和miR-126在UC和UCRCC腸組織中可能通過分別抑制Rhob.PDCD4 (miR-21),NFKBIA(miR-126)表達(dá)以發(fā)揮致病作用。
【關(guān)鍵詞】：潰瘍性結(jié)腸炎 疾病活動度評估 癌變監(jiān)測 MicroRNA 靶mRNA
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R574.62
【目錄】：

• 摘要5-9
• Abstract9-13
• 前言13-15
• 第一部分：UC疾病活動度和癌變監(jiān)測相關(guān)血清miRNAs初探15-33
• 材料與方法16-21
• 一、研究對象和候選血清miRNAs16
• 二、實驗設(shè)計16-17
• 三、實驗主要試劑及耗材17
• 四、實驗主要儀器17
• 五、實驗方法17-19
• 六、統(tǒng)計學(xué)分析19-21
• 實驗結(jié)果21-30
• 一、一般人口學(xué)資料和臨床特征21-23
• 二、候選血清miRNAs23-24
• 三、UC活動度評估候選miRNAs血清表達(dá)情況及評估效力24-28
• 四、UC癌變監(jiān)測的候選血清miRNAs的表達(dá)情況28-30
• 討論30-32
• 結(jié)論32-33
• 第二部分：miRNAs及對應(yīng)靶mRNA在小鼠UC和UCRCC模型腸組織表達(dá)關(guān)聯(lián)性和可能作用機(jī)制初探33-46
• 材料與方法35-38
• 一、研究對象35-36
• 二、實驗設(shè)計36
• 三、實驗主要試劑、耗材及儀器36
• 四、實驗方法36-37
• 五.統(tǒng)計學(xué)分析37-38
• 實驗結(jié)果38-42
• 一、miR-21和miR-126在小鼠模型中的表達(dá)變化38
• 二、miR-21和miR-126對應(yīng)靶mRNA在小鼠模型中的表達(dá)變化38-42
• 討論42-45
• 結(jié)論45-46
• 全文總結(jié)和展望46-47
• 參考文獻(xiàn)47-54
• 附錄 英文縮略語表54-55
• 綜述55-69
• 參考文獻(xiàn)63-69
• 致謝69-71

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