本文關(guān)鍵詞：TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路對(duì)肝細(xì)胞凋亡的影響及氧化苦參堿的干預(yù)機(jī)制研究

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【摘要】：第一部分TLR4/PI3K/AKT/GSK3β信號(hào)通路對(duì)大鼠肝BRL-3A細(xì)胞凋亡的影響目的探討大鼠肝BRL-3A細(xì)胞中是否有Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)介導(dǎo)的PI3K/AKT/GSK3β信號(hào)通路,及該通路在BRL-3A細(xì)胞凋亡中的作用與機(jī)制,為急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)的預(yù)防和治療提供新的靶點(diǎn)。方法采用大鼠肝BRL-3A細(xì)胞,運(yùn)用脂多糖(lipopolsaccharide,LPS)建立肝細(xì)胞凋亡模型。分別應(yīng)用TLR4抑制劑(CLI-095)、PI3K/AKT抑制劑(LY294002)和GSK3β抑制劑(LiCl)預(yù)處理BRL-3A細(xì)胞,以減弱或加強(qiáng)TLR4/PI3K/AKT/GSK3β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力;流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry,FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;Hoechst 33342染色法觀察LPS刺激及TLR4抑制劑阻斷后細(xì)胞凋亡的形態(tài);Western-blot法檢測(cè)BRL-3A細(xì)胞內(nèi)AKT、P-AKTSer473、GSK3β、P-GSK3βSer9、Bax、Bcl-2及active-caspase-3蛋白的表達(dá);實(shí)時(shí)定量PCR法(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)檢測(cè)BRL-3A細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2及caspase-3 mRNA的表達(dá);免疫熒光法觀察GSK3β核易位情況。結(jié)果(1)CCK-8法結(jié)果顯示,LPS(10μg/ml)刺激BRL-3A細(xì)胞不同時(shí)間(1、3、6、12、24 h)后,細(xì)胞活力均明顯低于對(duì)照組(P0.05),LPS作用于BRL-3A細(xì)胞24 h后其活力為對(duì)照組的58%(P0.05)。(2)Hoechst 33342染色法結(jié)果顯示,LPS刺激后,隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng),BRL-3A細(xì)胞凋亡增多,并出現(xiàn)壞死細(xì)胞,刺激24 h可見細(xì)胞核碎片和核固縮。TLR4抑制劑(CLI-095)預(yù)處理組凋亡細(xì)胞明顯減少,未見凋亡小體。(3)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,LPS(10μg/ml)刺激BRL-3A細(xì)胞不同時(shí)間(1、3、6、12、24h)后,細(xì)胞凋亡率逐漸上升(p0.01),24hbrl-3a細(xì)胞凋亡率達(dá)68.30%。與lps組比較,cli-095+lps組可以減少lps刺激引起的brl-3a細(xì)胞凋亡率(p0.05);ly294002+lps組細(xì)胞凋亡率增加(p0.05);licl+lps組細(xì)胞凋亡率下降(p0.05)。(4)western-blot法結(jié)果顯示,正常對(duì)照組brl-3a細(xì)胞中有akt、p-aktser473、gsk3β、p-gsk3βser9的表達(dá);lps組p-aktser473和p-gsk3βser9的表達(dá)低于正常對(duì)照組(p0.05);與lps組比較,cli-095+lps組p-aktser473和p-gsk3βser9的表達(dá)有所上調(diào);而ly294002+lps組的p-aktser473和p-gsk3βser9表達(dá)下調(diào)(p0.05);licl+lps組p-gsk3βser9的表達(dá)上調(diào)(p0.05)。(5)免疫熒光法檢測(cè)gsk3β核易位結(jié)果顯示,正常對(duì)照組中g(shù)sk3β主要表達(dá)在brl-3a細(xì)胞質(zhì)中;lps組gsk3β大多易位到胞核;與lps組比較,cli-095、licl預(yù)處理組gsk3β核易位均不同程度減弱,ly294002預(yù)處理組gsk3β核易位作用增強(qiáng)。(6)rt-qpcr法檢測(cè)結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,lps組bax/bcl-2及caspase-3mrna的表達(dá)均上調(diào)(p0.05);與lps組比較,cli-095+lps組及l(fā)icl+lps組bax/bcl-2及caspase-3mrna表達(dá)降低(p0.05);ly294002+lps組bax/bcl-2及caspase-3mrna表達(dá)上調(diào)(p0.05)。(7)western-blot法測(cè)定結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,lps組bax/bcl-2及active-caspase-3表達(dá)均上調(diào)(p0.05)。與lps組比較,cli-095+lps組及l(fā)icl+lps組bax/bcl-2及active-caspase-3表達(dá)降低(p0.05);ly294002+lps組bax/bcl-2及active-caspase-3表達(dá)上調(diào)(p0.05)。結(jié)論(1)brl-3a細(xì)胞中有tlr4介導(dǎo)的pi3k/akt/gsk3β信號(hào)通路。(2)brl-3a細(xì)胞tlr4激活后,p-aktser473和p-gsk3βser9表達(dá)下調(diào),使bax/bcl-2及active-caspase-3的表達(dá)增加,細(xì)胞凋亡率升高。brl-3a細(xì)胞凋亡過(guò)程中有tlr4介導(dǎo)的pi3k/akt/gsk3β信號(hào)通路的參與。第二部分tlr4/p38/jnk信號(hào)通路對(duì)大鼠肝brl-3a細(xì)胞凋亡的影響目的探討大鼠肝brl-3a細(xì)胞中是否有tlr4介導(dǎo)的p38/jnk信號(hào)通路,及該通路在brl-3a細(xì)胞凋亡中的作用與機(jī)制,為急性肝衰竭的預(yù)防和治療提供新的靶點(diǎn)。方法采用大鼠肝brl-3a細(xì)胞,應(yīng)用lps建立肝細(xì)胞凋亡模型。分別運(yùn)用tlr4抑制劑(cli-095)、p38抑制劑(sb203580)、jnk抑制劑(sp600125)及erk抑制劑(fr180204)預(yù)處理brl-3a細(xì)胞,以影響tlr4/p38/jnk信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;western-blot法檢測(cè)brl-3a細(xì)胞內(nèi)jnk、p-jnk、p38、p-p38、bax、bcl-2及active-caspase-3蛋白的表達(dá);rt-qpcr檢測(cè)大鼠肝細(xì)胞bax、bcl-2及caspase-3mrna的表達(dá)。結(jié)果(1)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,lps組細(xì)胞凋亡率高于正常對(duì)照組(p0.05);而cli-095+lps組、sb203580+lps組、sp600125+lps組細(xì)胞凋亡率顯著低于lps組(p0.05);fr180204+lps與lps組比較無(wú)明顯差異。(2)western-blot結(jié)果顯示,lps組p-p38,p-jnk表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組(p0.05);cli-095+lps組、sb203580+lps組、sp600125+lps組p-p38,p-jnk表達(dá)顯著低于lps組(p0.05);fr180204+lps組與lps組比較無(wú)明顯差異。(3)rt-qpcr結(jié)果顯示,lps組bax/bcl-2及caspase-3mrna明顯高于正常對(duì)照組(p0.05);cli-095+lps組、sb203580+lps組和sp60012+lps組bax/bcl-2及caspase-3mrna表達(dá)均顯著低于lps組(p0.05);fr180204+lps組bax/bcl-2及caspase-3mrna表達(dá)無(wú)明顯變化。(4)western-blot結(jié)果顯示,lps組bax/bcl-2及active-caspase-3表達(dá)比正常對(duì)照組高(p0.05);cli-095+lps組、sb203580+lps組和sp60012+lps組bax/bcl-2及active-caspase-3表達(dá)顯著低于lps組(p0.05);fr180204+lps組與lps組比較無(wú)明顯差異。結(jié)論(1)brl-3a細(xì)胞中有tlr4介導(dǎo)的p38/jnk信號(hào)通路。(2)brl-3a細(xì)胞tlr4激活后,p-p38、p-jnk表達(dá)增加,使bax/bcl-2的比例和active-caspase-3表達(dá)增加,從而促進(jìn)brl-3a細(xì)胞的凋亡。brl-3a細(xì)胞凋亡過(guò)程中有tlr4介導(dǎo)的p38/jnk信號(hào)通路的參與。第三部分氧化苦參堿對(duì)大鼠肝brl-3a細(xì)胞凋亡的抑制作用及其機(jī)制研究目的探討氧化苦參堿(oxymatrine,omt)對(duì)lps誘導(dǎo)的大鼠肝brl-3a細(xì)胞凋亡的抑制作用及其機(jī)制,為omt抑制肝細(xì)胞凋亡提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法采用lps誘導(dǎo)大鼠肝brl-3a細(xì)胞建立細(xì)胞凋亡模型。應(yīng)用cck-8法測(cè)定omt對(duì)brl-3a細(xì)胞活力的影響;生物化學(xué)法測(cè)定不同劑量omt對(duì)lps誘導(dǎo)的brl-3a細(xì)胞乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,ldh)釋放率的影響。根據(jù)ldh釋放率選擇omt濃度為0.75、1.5、3.0g/l進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。然后實(shí)驗(yàn)分5組:正常對(duì)照組,lps組,omt低劑量+lps組,omt中劑量+lps組,omt高劑量+lps組。hochest33342染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài);流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;rt-qpcr法檢測(cè)brl-3a細(xì)胞中bax、bcl-2、caspase-3mrna的表達(dá);western-blot法檢測(cè)brl-3a細(xì)胞中akt、p-aktser473、gsk3β、p-gsk3βser9、p38、p-p38、jnk、p-jnk、bax、bcl-2和active-caspase-3蛋白的表達(dá);免疫熒光觀察gsk3β核易位情況。結(jié)果(1)不同劑量的(0.375~6.0g/l)omt和brl-3a細(xì)胞共培養(yǎng)24h,brl-3a細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。(2)lps刺激brl-3a細(xì)胞后,ldh釋放率增加(p0.01),而omt預(yù)處理后能明顯降低ldh的釋放率(p0.05或p0.01)。(3)cck-8法結(jié)果顯示,lps組細(xì)胞活力明顯降低(p0.05),omt預(yù)處理可以明顯減弱由lps引起的細(xì)胞活力降低(p0.05或p0.01)。(4)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:lps組brl-3a細(xì)胞凋亡率明顯高于正常對(duì)照組(p0.05),omt預(yù)處理可以顯著降低由lps刺激引起brl-3a細(xì)胞凋亡率的增加(p0.05)。(5)hochest33342染色結(jié)果顯示,lps組可見brl-3a細(xì)胞凋亡增多,omt預(yù)處理后凋亡細(xì)胞明顯減少。(6)western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示,lps組tlr4表達(dá)增加(p0.05),p-aktser473和p-gsk3βser9表達(dá)降低(p0.05),p-p38、p-jnk表達(dá)增加(p0.05);與lps組比較,omt中、高劑量預(yù)處理可以下調(diào)tlr4的表達(dá),并上調(diào)p-aktser473和p-gsk3βser9的表達(dá)(p0.05),下調(diào)p-p38、p-jnk的表達(dá)(p0.05或p0.01)。(7)免疫熒光結(jié)果顯示,omt預(yù)處理能明顯減少lps刺激引起的gsk3β核易位。(8)rt-qpcr結(jié)果顯示,lps組bax/bcl-2及caspase-3mrna表達(dá)明顯增高(p0.05)。與lps組比較,omt預(yù)處理能明顯降低由lps誘導(dǎo)的brl-3a細(xì)胞中bax/bcl-2及caspase-3mrna表達(dá)上調(diào)(p0.05或p0.01)。(9)western-blot結(jié)果顯示,omt預(yù)處理能明顯降低由lps誘導(dǎo)的brl-3a細(xì)胞中bax/bcl-2及active-caspase-3表達(dá)上調(diào)(p0.05)。結(jié)論(1)omt預(yù)處理可以顯著降低由lps誘導(dǎo)的brl-3a細(xì)胞凋亡。(2)omt能上調(diào)經(jīng)lps刺激的brl-3a細(xì)胞p-aktser473和p-gsk3βser9水平,減少lps刺激引起的gsk3β核易位,降低經(jīng)lps激活的p38和jnk磷酸化水平,下調(diào)bax/bcl-2的比例和active-caspase-3的表達(dá),從而明顯抑制brl-3a細(xì)胞凋亡。(3)omt通過(guò)tlr4/pi3k/akt/gsk3β及tlr4/p38/jnk信號(hào)通路抑制brl-3a細(xì)胞凋亡。第四部分氧化苦參堿對(duì)急性肝衰竭大鼠肝細(xì)胞凋亡的抑制作用及其機(jī)制研究目的探討氧化苦參堿(omt)對(duì)lps/d-galn誘導(dǎo)的急性肝衰竭大鼠肝細(xì)胞凋亡的抑制作用及其機(jī)制,為臨床防治急性肝衰竭抑制肝細(xì)胞凋亡尋找有效的藥物。方法采用lps/d-galn建立大鼠急性肝衰竭模型。100只大鼠隨機(jī)分為5組:正常對(duì)照組,模型組,omt低、中、高劑量組。應(yīng)用he染色光鏡觀察肝臟病理學(xué)改變;透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡情況;全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanineaminotransferase,alt)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartateaminotransferase,ast)水平;elisa法測(cè)定各組大鼠外周血腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor,tnf-α)和白介素-1β(interleukin-1β,il-1β)水平;流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定各組大鼠肝細(xì)胞凋亡率;western-blot檢測(cè)肝組織中akt、p-aktser473、gsk3β、p-gsk3βser9、p38、p-p38、jnk、p-jnk、bax、bcl-2和active-caspase-3的表達(dá)。免疫組化s-p法觀察肝組織tlr4、bax、bcl-2和active-caspase-3的表達(dá);結(jié)果(1)各組大鼠死亡率及肝臟大體情況,正常對(duì)照組和omt低、中、高劑量組無(wú)大鼠死亡;模型組大鼠死亡率達(dá)30%。模型組可見肝臟大體腫脹明顯,表面彌漫出血,大片瘀斑,呈暗紅色,omt低、中、高劑量組肝臟大體不同程度的好轉(zhuǎn)。(2)he染色見模型組肝細(xì)胞明顯壞死,大片狀壞死和出血,僅少量肝細(xì)胞殘存,散在分布,無(wú)正常肝小葉結(jié)構(gòu),纖維網(wǎng)狀支架塌陷,匯管區(qū)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。透射電鏡顯示模型組肝細(xì)胞壞死明顯,形態(tài)不規(guī)則,可見核皺縮和核碎裂,見凋亡小體,肝細(xì)胞內(nèi)線粒體嚴(yán)重?fù)p害,無(wú)明顯細(xì)胞器結(jié)構(gòu)。omt各劑量預(yù)處理可不同程度改善肝組織病理?yè)p傷。(3)生化分析儀測(cè)定結(jié)果顯示,模型組大鼠外周血ast、alt的水平明顯高于正常對(duì)照組(p0.05),omt各劑量組,ast、alt的水平顯著低于模型組(p0.05)。(4)elisa法結(jié)果顯示,模型組大鼠外周血tnf-α和il-1β水平明顯高于正常對(duì)照組(P0.01),OMT各劑量組,TNF-α和IL-1β水平顯著低于模型組(P0.05或P0.01)。(5)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,模型組肝細(xì)胞凋亡率明顯增加(P0.05),與模型組比較,OMT中、高劑量預(yù)處理可以降低肝細(xì)胞凋亡率(P0.05)。(6)Western-blot法結(jié)果顯示,模型組TLR4表達(dá)增加(P0.05),P-AKTSer473和P-GSK3βSer9表達(dá)降低(P0.05),P-P38、P-JNK表達(dá)增加(P0.05);與模型組比較,OMT中、高劑量預(yù)處理可以下調(diào)TLR4的表達(dá)(P0.05),并上調(diào)P-AKTSer473和P-GSK3βSer9的表達(dá)(P0.05),下調(diào)P-P38、P-JNK的表達(dá)(P0.05)。(7)Western-blot法檢測(cè)Bax/Bcl-2比例和active-caspase-3蛋白結(jié)果顯示,模型組Bax/Bcl-2比例和active-caspase-3蛋白的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組(P0.05)。與模型組比較,OMT預(yù)處理可下調(diào)Bax/Bcl-2比例和active-caspase-3蛋白的表達(dá)(P0.05)。(8)免疫組化法結(jié)果顯示,模型組TLR4、Bax、active-caspase-3表達(dá)明顯增高,Bcl-2的表達(dá)較正常對(duì)照組有所下降(P0.05)。與模型組比較,OMT預(yù)處理可下調(diào)TLR4、active-caspase-3及Bax的表達(dá),上調(diào)Bcl-2的表達(dá)(P0.05)。結(jié)論(1)OMT預(yù)處理能改善LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝衰竭大鼠肝組織病理?yè)p傷,明顯降低血清轉(zhuǎn)氨酶,保護(hù)肝細(xì)胞。(2)OMT能降低急性肝衰竭大鼠肝組織TLR4的表達(dá)、上調(diào)P-AKTSer473和P-GSK3βSer9的表達(dá),下調(diào)GSK3β表達(dá);下調(diào)P-P38、P-JNK的表達(dá),使TNF-α和IL-1β水平降低,下調(diào)Bax/Bcl-2比例和active-caspase-3蛋白的表達(dá),從而明顯抑制肝細(xì)胞凋亡。(3)OMT通過(guò)TLR4/PI3K/AKT/GSK3β及TLR4/P38/JNK信號(hào)通路抑制急性肝衰竭大鼠肝細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：BRL-3A細(xì)胞 大鼠急性肝衰竭 TLR4/PI3K/AKT/GSK3β TLR4/P38/JNK 細(xì)胞凋亡 氧化苦參堿
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R575.3
【目錄】：

• 中文摘要4-11
• Abstract11-21
• 引言21-23
• 第一部分 TLR4/PI3K/AKT/GSK3Β 信號(hào)通路對(duì)大鼠肝BRL-3A細(xì)胞凋亡的影響23-55
• 1.1 前言23
• 1.2 材料23-27
• 1.3 方法27-38
• 1.4 結(jié)果38-48
• 1.5 討論48-54
• 1.6 小結(jié)54-55
• 第二部分 TLR4/P38/JNK信號(hào)通路對(duì)大鼠肝BRL-3A細(xì)胞凋亡的影響55-67
• 2.1 前言55
• 2.2 材料55-56
• 2.3 方法56-57
• 2.4 結(jié)果57-62
• 2.5 討論62-66
• 2.6 小結(jié)66-67
• 第三部分 氧化苦參堿對(duì)BRL-3A細(xì)胞凋亡的抑制作用及其機(jī)制研究67-86
• 3.1 前言67-68
• 3.2 材料68
• 3.3 方法68-71
• 3.4 結(jié)果71-80
• 3.5 討論80-85
• 3.6 小結(jié)85-86
• 第四部分 氧化苦參堿對(duì)急性肝衰竭大鼠肝細(xì)胞凋亡抑制作用及其機(jī)制研究86-130
• 4.1 前言86
• 4.2 材料86-87
• 4.3 方法87-92
• 4.4 結(jié)果92-121
• 4.5 討論121-128
• 4.6 小結(jié)128-130
• 參考文獻(xiàn)130-145
• 綜述 肝細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑研究進(jìn)展145-180
• 參考文獻(xiàn)166-180
• 英文縮略詞表180-182
• 攻讀學(xué)位期間取得的科研成果182-183
• 致謝183-184

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本文編號(hào)：899892