本文關(guān)鍵詞：沉默KLF4基因?qū)Ω涡菭罴?xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機制的研究

  更多相關(guān)文章： 肝纖維化 Krüppel樣因子 肝星狀細(xì)胞 RNA干擾 TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

【摘要】：病毒性肝炎是我國最常見的疾病之一,感染人數(shù)位居世界第一,而且近些年來,酒精性肝病和脂肪性肝病發(fā)病率也逐年增高,這些疾病都有發(fā)展成肝纖維化的可能,肝纖維化已經(jīng)成為了我國的常見病、多發(fā)病。肝纖維化是肝臟對各種病因(如病毒感染、酒精濫用、膽汁淤積、代謝性疾病、自身免疫性疾病、寄生蟲感染等)所引起的慢性損傷的一種反應(yīng),由多種氧化應(yīng)激細(xì)胞因子和生長因子等復(fù)雜作用所產(chǎn)生,是各種慢性肝病向肝硬化進(jìn)展的共同環(huán)節(jié)。其病理表現(xiàn)為肝組織內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)尤其是膠原的過度增生與異常沉積,引起肝臟結(jié)構(gòu)異常,并影響肝臟的功能。但是肝纖維化是一個可逆的病理過程,多項研究證實去除上述的各種致病因素,可以明顯的減輕肝纖維化,使肝臟功能恢復(fù)正常。但是,如果致病因素沒有及時去除,則會進(jìn)展成為失代償期肝硬化,而一旦發(fā)展成為肝硬化,即使進(jìn)行有效地治療,也不能恢復(fù)正常。有報道顯示,肝硬化5年后有17%的患者發(fā)展成為肝癌,而10年后超過40%的患者發(fā)展為肝癌。因此,提前預(yù)防和干預(yù)肝纖維化,使其逆轉(zhuǎn)或者延遲其發(fā)展,對于提高患者生活質(zhì)量、改善預(yù)后有非常重要的作用。當(dāng)前的很多研究已經(jīng)證實,肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)的激活是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。各種因素通過不同方式和途徑作用于肝臟中的HSCs以及纖維形成細(xì)胞,導(dǎo)致其生物學(xué)及功能變化,引起肝纖維化。研究認(rèn)為HSCs是正常及纖維化肝臟中的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的主要合成細(xì)胞,其合成量是肝細(xì)胞的10倍、內(nèi)皮細(xì)胞的20倍以上。ECM成分的維持需要ECM合成與降解保持動態(tài)平衡,基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)是影響ECM降解的主要因素,而它的活性主要受組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)的調(diào)節(jié)。正常情況下,HSCs能分泌多種膠原酶和基質(zhì)降解蛋白酶如MMP-1、MMP-2等以降解各種ECM,同時分泌TIMP-1防止膠原過度降解,使肝臟ECM的合成和分解處在一個動態(tài)平衡中。Krüppel樣因子(Krüppel-like factors,KLFs)是一類具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子家族。他們都包含CX2CX3FX5LX2HX3H這樣一個與DNA結(jié)合的極端保守序列。到目前為止,KLFs家族已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了至少25個成員。這些因子在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞增殖、凋亡、分化、胚胎發(fā)育和體細(xì)胞重構(gòu)等方面發(fā)揮著重要的作用。同時,KLFs家族在各種疾病,例如在ECM的重構(gòu)中也發(fā)揮著重要的作用。人KLF4是在1998年采用包含鋅指結(jié)構(gòu)的DNA探針在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的c DNA文庫中首次發(fā)現(xiàn)的。KLF4有很多重要的功能,例如調(diào)節(jié)某些特定細(xì)胞的增殖和分化,并且最近的研究已經(jīng)顯示KLF4可以調(diào)節(jié)一些基因例如MMP-1,TGF-β在肌成纖維細(xì)胞中的表達(dá)。而我們已經(jīng)知道,這些基因在ECM的重構(gòu)方面發(fā)揮著重要作用。故KLF4可能對肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展有調(diào)節(jié)作用。然而,關(guān)于KLF4在肝纖維化中的作用仍不清楚。本研究的目的主要是闡明KLF4在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用機制,為肝纖維化的防治奠定理論基礎(chǔ)。因此,本實驗在前期實驗的基礎(chǔ)上,設(shè)計合成了針對大鼠靶向KLF4的RNA干擾質(zhì)粒載體以及針對人KLF4的小干擾RNA(small interfering RNA,si RNA),篩選出沉默效果最好的干擾質(zhì)粒載體以及si RNA,觀察沉默KLF4表達(dá),對大鼠HSC-T6以及人HSC-LX2細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,并探討KLF4沉默對兩種細(xì)胞膠原代謝以及相關(guān)酶類的影響。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步分析了其對TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用。實驗內(nèi)容主要包括以下三部分:第一部分沉默KLF4表達(dá)對肝星狀細(xì)胞生物學(xué)行為的影響目的:篩選有效沉默KLF4基因表達(dá)的si RNA以及干擾質(zhì)粒。觀察KLF4基因沉默對人肝星狀細(xì)胞HSC-LX2以及大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6生物學(xué)特性的影響。方法:設(shè)計并化學(xué)合成針對人KLF4 m RNA 909,1332和1682位點的3對21個核苷酸(nt)的si RNA(si RNA1,si RNA2,si RNA3),轉(zhuǎn)染人肝星狀細(xì)胞株HSC-LX2。以轉(zhuǎn)染非特異si RNA(NC si RNA,與KLF4 m RNA無同源性的21 nt si RNA)作為陰性對照。同時,設(shè)計并構(gòu)建針對大鼠KLF4基因的3個干擾質(zhì)粒(p GPU6-1,p GPU6-2,p GPU6-3)以及陰性對照。提取上述兩種細(xì)胞RNA,采用實時熒光定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)方法分析KLF4 m RNA表達(dá)情況。提取兩種細(xì)胞總蛋白,采用western blot的方法分析KLF4蛋白的表達(dá)情況,篩選出沉默KLF4效果最好的1個si RNA和干擾質(zhì)粒。將沉默效果最好的si RNA和干擾質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HSC-LX2和HSC-T6,然后,用MTT法檢測KLF4沉默對肝星狀細(xì)胞增殖的影響。采用Brd U法測定細(xì)胞DNA合成。采用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子:轉(zhuǎn)化生長因子b1(transforming growth factor,TGF-b1)、白介素1b(interleukin-1b,IL-1b)和腫瘤壞死因子a(tumor necrosis factor-a,TNF-a)的表達(dá)情況。結(jié)果:Real-time RT-PCR結(jié)果顯示3對si RNA(si RNA1,si RNA2,si RNA3)和對照組相比KLF4 m RNA的表達(dá)分別是65.9%,60.2%和31.3%(P0.05),其中si RNA3組對KLF4 m RNA的沉默效果最好。三條干擾載體質(zhì)粒p GPU6(p GPU6-1,p GPU6-2,p GPU6-3)和對照組相比,KLF4m RNA的表達(dá)分別是60.1%,54.8%和28.2%(P0.05),故p GPU6-3組對KLF4 m RNA的沉默效果最好。western blot的結(jié)果顯示與內(nèi)參蛋白β-actin相比,3對si RNA(si RNA1,si RNA2,si RNA3)組KLF4蛋白表達(dá)分別是61.4%,58.6%和32.2%(P0.05)。與m RNA的結(jié)果類似,si RNA3組對KLF4蛋白的沉默效果最好。故后續(xù)試驗均采用si RNA3沉默HSC-LX2的KLF4的表達(dá)。3個干擾質(zhì)粒p GPU6(p GPU6-1,p GPU6-2,p GPU6-3)組KLF4蛋白表達(dá)分別為51.3%,47.5%和30.5%(P0.05)。同樣,p GPU6-3組對KLF4蛋白的沉默效果最好。故后續(xù)試驗均采用p GPU6-3沉默HSC-T6的KLF4的表達(dá)。si RNA3轉(zhuǎn)染HSC-LX2細(xì)胞后,同陰性對照組相比,MTT實驗結(jié)果顯示,在12h、24h和48h,細(xì)胞活力分別降為75.56%,52.35%和50.14%(P0.05)。p GPU6-3轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞后,同陰性對照組相比,MTT實驗結(jié)果顯示,在12h、24h和48h,細(xì)胞活力分別降為68.94%,49.15%和45.04%(P0.05)。根據(jù)MTT檢測結(jié)果,選擇轉(zhuǎn)染后48h檢測各組細(xì)胞DNA合成。Brd U法檢測顯示在HSC-LX2細(xì)胞,si RNA3組同對照組相比,DNA合成降為46.38%。在HSC-T6細(xì)胞,p GPU6-3組DNA合成降為40.21%。si RNA3轉(zhuǎn)染HSC-LX2細(xì)胞48h后,ELISA結(jié)果顯示與對照組比較,TGF-β1表達(dá)量下降到原來的29.21%,TNF-a表達(dá)量下降到原來的72.91%,IL-1β表達(dá)量下降到原來的51.25%。同樣,p GPU6-3轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞48h后,ELISA法結(jié)果也顯示與對照組比較,TGF-β1表達(dá)量下降到原來的25.76%,TNF-a表達(dá)量下降到原來的65.94%,IL-1β表達(dá)量下降到原來的46.32%。與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:篩選出可靠沉默KLF4表達(dá)的si RNA3和干擾質(zhì)粒p GPU6-3。KLF4基因沉默可以影響兩種肝星狀細(xì)胞(HSC-LX2、HSC-T6)生物學(xué)行為,抑制兩種肝星狀細(xì)胞的增殖。兩種肝星狀細(xì)胞中的促進(jìn)膠原表達(dá)的三種細(xì)胞因子TGF-b1、IL-1b以及TNF-a表達(dá)量下降。第二部分沉默KLF4表達(dá)對肝星狀細(xì)胞膠原蛋白代謝及相關(guān)酶類的影響目的:探討沉默KLF4表達(dá)后,對HSC-LX2和HSC-T6細(xì)胞膠原蛋白代謝以及相關(guān)酶類的影響,為下一步機制研究奠定基礎(chǔ)。方法:將篩選出來的沉默KLF4效果最好的si RNA3,轉(zhuǎn)染人HSC-LX2細(xì)胞。沉默KLF4效果最好的干擾質(zhì)粒p GPU6-3,轉(zhuǎn)染大鼠HSC-T6細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24小時和48小時后分別采用Real-time RT-PCR法和western blot的方法檢測I型膠原、III型膠原、MMP-1、MMP-13、TIMP-1 m RNA和蛋白的表達(dá)。Real-time RT-PCR法以GAPDH為內(nèi)參照,用2-△△Ct法進(jìn)行分析計算。western blot的方法以β-actin蛋白為內(nèi)參照,進(jìn)行分析。結(jié)果:Real-time RT-PCR結(jié)果顯示。si RNA3轉(zhuǎn)染人HSC-LX2細(xì)胞后,I型膠原、III型膠原和TIMP-1相對于對照組的m RNA表達(dá)分別下降為31.3%,42.4%和53.2%;而MMP-1 m RNA的表達(dá)則上升為169.1%。p GPU6-3轉(zhuǎn)染大鼠HSC-T6細(xì)胞后,I型膠原、III型膠原和TIMP-1相對于對照組的m RNA表達(dá)分別下降為35.8%,29.8%和47.8%;而MMP-13 m RNA的表達(dá)則上升為171.2%。Western Blot檢測中,si RNA3轉(zhuǎn)染人HSC-LX2細(xì)胞后,以β-actin為內(nèi)參照,I型膠原蛋白,III型膠原蛋白和TIMP-1蛋白的表達(dá)分別下降為37.3%,45.3%和42.1%;而MMP-1蛋白的表達(dá)則上升為85.4%。p GPU6-3轉(zhuǎn)染大鼠HSC-T6細(xì)胞后,以β-actin為內(nèi)參照,I型膠原蛋白,III型膠原蛋白和TIMP-1蛋白的表達(dá)分別下降為32.6%,28.3%和33.1%;而MMP-13蛋白的表達(dá)則上升為127.3%。結(jié)論:KLF4基因沉默可以顯著減少人HSC-LX2細(xì)胞以及大鼠HSC-T6細(xì)胞I型膠原蛋白和III膠原蛋白的表達(dá)。其機制可能是和增加MMP-1、MMP-13表達(dá),而抑制TIMP-1的表達(dá)有關(guān)。第三部分 KLF4對TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用目的:沉默KLF4在HSC-T6細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)而對KLF4在TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用進(jìn)行初步研究。方法:大鼠HSC-T6復(fù)蘇后接種于含12%胎牛血清,100U/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中。置于5%CO2 37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)。按如下分組進(jìn)行試驗①Control組,只用含12%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。②TGF-β1組,在含12%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中加入TGF-β1細(xì)胞干預(yù)液,使其終濃度為50ng/ml。③p GPU6-3組,將干擾質(zhì)粒p GPU6-3轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞。④TGF-β1+p GPU6-3組,將干擾質(zhì)粒p GPU6-3轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞24h后,再加入TGF-β1細(xì)胞干預(yù)液,使其終濃度為50ng/ml。Real-time RT-PCR檢測HSC-T6細(xì)胞中Smad2,Smad3,Smad7及GAPDH m RNA的表達(dá)。Western blot技術(shù)檢測HSCs-T6細(xì)胞中的Smad2蛋白,磷酸化的p-Smad2蛋白,Smad3蛋白,磷酸化的p-Smad3蛋白,Smad7蛋白及內(nèi)參β-actin蛋白。結(jié)果:Real-time RT-PCR結(jié)果顯示TGF-β1組,p GPU6-3組和TGF-β1+p GPU6-3組中Smad2相對于Control組的m RNA的表達(dá)分別是130.1%,97.6%和129.7%;三組中Smad3相對于Control組的m RNA的表達(dá)分別是121.0%,98.0%和119.7%;三組中Smad7相對于Control組的m RNA的表達(dá)分別是111.6%,157.9%和141.6%�？梢�,p GPU6-3組與Control組比較,Smad2和Smad3 m RNA表達(dá)無明顯變化,而p GPU6-3組和TGF-β1+p GPU6-3組的Smad7 m RNA表達(dá)比Control組增多。以β-actin蛋白為對照,則Smad2蛋白在Control組,TGF-β1組,p GPU6-3組和TGF-β1+p GPU6-3組中的蛋白的表達(dá)分別是24.1%,33.5%,23.2%和32.5%。Smad3蛋白在四組中的蛋白的表達(dá)分別是33.5%,43.7%,32.5%和42.9%。與m RNA的結(jié)果類似,p GPU6-3組與Control組比較,Smad2和Smad3蛋白表達(dá)也無明顯變化。而磷酸化的p-Smad2蛋白在四組中的蛋白的表達(dá)分別是73.6%,93.9%,34.4%和55.9%。磷酸化的p-Smad3蛋白在四組中的蛋白的表達(dá)分別是69.6%,98.8%,23.5%和43.0%�？梢钥闯�,p GPU6-3組和TGF-β+p GPU6-3組與Control組比較,p-Smad2和p-Smad3蛋白表達(dá)明顯減少。Smad7蛋白在四組中的蛋白的表達(dá)分別是30.5%,37.1%,65.4%和51.9%,可見與m RNA的結(jié)果類似,p GPU6-3組和TGF-β1+p GPU6-3組的Smad7蛋白表達(dá)比Control組增多。第三部分KLF4對TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用結(jié)論:KLF4沉默減少了Smad2和Smad3蛋白磷酸化,增加了Smad7蛋白的表達(dá)。故KLF4促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖和膠原代謝,可能和其抑制TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：肝纖維化 Krüppel樣因子 肝星狀細(xì)胞 RNA干擾 TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R575.2
【目錄】：

• 中文摘要5-11
• 英文摘要11-19
• 英文縮寫19-20
• 引言20-22
• 第一部分 沉默KLF4 表達(dá)對肝星狀細(xì)胞生物學(xué)行為的影響22-55
• 前言22-23
• 材料與方法23-36
• 結(jié)果36-40
• 附圖40-47
• 附表47-49
• 討論49-50
• 小結(jié)50-51
• 參考文獻(xiàn)51-55
• 第二部分 沉默KLF4 表達(dá)對肝星狀細(xì)胞膠原蛋白代謝及相關(guān)酶類的影響55-71
• 前言55-56
• 材料與方法56-59
• 結(jié)果59-61
• 附圖61-65
• 附表65-67
• 討論67-68
• 小結(jié)68
• 參考文獻(xiàn)68-71
• 第三部分KLF4 對TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用71-85
• 前言71-72
• 材料與方法72-74
• 結(jié)果74-76
• 附圖76-78
• 附表78-80
• 討論80-81
• 小結(jié)81
• 參考文獻(xiàn)81-85
• 結(jié)論85-86
• 綜述一 肝星狀細(xì)胞與肝纖維化86-98
• 參考文獻(xiàn)94-98
• 綜述二 TGF-β信號通路與肝纖維化98-111
• 參考文獻(xiàn)105-111
• 致謝111-112
• 個人簡歷112-11

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 段宏凱;;肝纖維化實驗研究進(jìn)展[J];中國醫(yī)藥科學(xué);2013年03期

2 Amr M.GHALEB,Mandayam O.NANDAN,Sengthong CHANCHEVALAP,W.Brian DALTON,Irfan M.HISAMUDDIN,Vincent W.YANG;Krüppel-like factors 4 and 5:the yin and yang regulators of cellular proliferation[J];Cell Research;2005年02期

3 ;Effect of Oxymatrine on the TGFbeta-Smad signaling pathway in rats with CCl_4-induced hepatic fibrosis[J];World Journal of Gastroenterology;2008年13期

4 ;Paclitaxel ameliorates fibrosis in hepatic stellate cells via inhibition of TGF-β/Smad activity[J];World Journal of Gastroenterology;2010年26期

5 Sun-Jae Lee;Kyung-Hyun Kim;Kwan-Kyu Park;;Mechanisms of fibrogenesis in liver cirrhosis:The molecular aspects of epithelial-mesenchymal transition[J];World Journal of Hepatology;2014年04期

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本文編號：899873