本文關(guān)鍵詞：自殺基因調(diào)節(jié)異基因免疫細(xì)胞對(duì)肝細(xì)胞癌和慢性丙型肝炎治療的實(shí)驗(yàn)研究

  更多相關(guān)文章： 過(guò)繼免疫治療 肝細(xì)胞癌 自殺基因 丙型肝炎

【摘要】：肝細(xì)胞癌是全世界范圍內(nèi)的一個(gè)主要的健康問(wèn)題,是世界第六位最常見(jiàn)的腫瘤和第三位最常見(jiàn)的癌癥相關(guān)死亡疾病。全球每年有超過(guò)600000例新病例被診斷為肝癌。目前對(duì)HCC的根治性治療方式(例如射頻消融和外科手術(shù)切除)常因腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或是患者就診時(shí)已屬于中晚期而難以取得滿意的治療效果。肝移植是對(duì)于肝癌特別是合并肝硬化肝癌理想的治療手段,然而,由于供肝的缺乏,肝移植只能治療少數(shù)HCC患者,特別是對(duì)于伴有HCV感染的患者,肝移植常因供肝的再感染而導(dǎo)致治療的失敗甚至加重病情的發(fā)展。因此,新的有效的治療方式可能是提高HCC患者治愈率和降低病死率的希望。丙型肝炎病毒感染是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題,由于其高患病率和嚴(yán)重并發(fā)癥——肝硬化和肝癌,嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康。大量針對(duì)病毒相關(guān)因素(蛋白酶或聚合酶)和宿主因素的靶向性藥物對(duì)HCV的慢性感染治療方面已經(jīng)取得了較大進(jìn)展并開(kāi)始運(yùn)用于臨床,極大的提高HCV的治療效果。然而,對(duì)于接受肝移植的HCV患者,由于抗病毒藥物間及與免疫抑制劑的的相互作用而受到明顯限制,因此,需要新的治療方式以預(yù)防HCV的移植后再感染,同時(shí)提高HCC的治療效果。目前,過(guò)繼免疫治療治療腫瘤已經(jīng)成為腫瘤治療的主要甚至是標(biāo)準(zhǔn)治療方式,其主要是通過(guò)激活或修復(fù)機(jī)體免疫系統(tǒng)或是通過(guò)免疫效應(yīng)細(xì)胞的運(yùn)用而達(dá)到治療腫瘤的目的。然而,這些方法絕大部分是通過(guò)自體免疫細(xì)胞,即來(lái)源于患者自身的免疫細(xì)胞,因此其面臨的問(wèn)題是,這些來(lái)自于處于對(duì)病原體和／或其他治療處于免疫抑制的患者免疫細(xì)胞,在體外的激活和擴(kuò)增能力都非常有限,同時(shí),提取的免疫細(xì)胞只能運(yùn)用患者本人,限制了其運(yùn)用的廣泛性,因此并未取得明顯的臨床效果。目前,免疫治療的發(fā)展極大的受限于免疫效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量及功能擴(kuò)增的技術(shù)難度及特定的可接受治療患者,而建立一個(gè)備用的異基因細(xì)胞庫(kù)(即來(lái)自于不同患者或是健康人群的外周血淋巴細(xì)胞,體外擴(kuò)增或激活以獲得更強(qiáng)的免疫活性),由其提供充足的細(xì)胞來(lái)源,與自體來(lái)源的免疫細(xì)胞(來(lái)源于患者本人)相比無(wú)疑將可能促進(jìn)免疫治療的發(fā)展和運(yùn)用。我們的本項(xiàng)研究課題,據(jù)目前所知,是首次將異基因免疫細(xì)胞運(yùn)用于對(duì)實(shí)體腫瘤(非血液系統(tǒng)腫瘤)和抗病毒治療。[研究目的]1.異基因性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞庫(kù)的建立：異基因反應(yīng)性表現(xiàn)為個(gè)體的淋巴細(xì)胞系統(tǒng)當(dāng)面對(duì)其他個(gè)體來(lái)源的組織或細(xì)胞時(shí),能夠?qū)Ξ愺w的細(xì)胞或組織發(fā)生反應(yīng)。異基因反應(yīng)性可以發(fā)揮其諸如抗腫瘤的特性,但也往往帶來(lái)的嚴(yán)重毒副反應(yīng)——移植物抗宿主反應(yīng)。而在異基因免疫效應(yīng)細(xì)胞臨床運(yùn)用之前導(dǎo)入條件性毒性基因,即自殺基因,通過(guò)自殺基因的前體藥物的使用可以誘導(dǎo)表達(dá)自殺基因的異基因過(guò)繼免疫細(xì)胞的死亡,從而控制此毒副反應(yīng)的發(fā)生。目前運(yùn)用較廣泛的自殺基因包括：?jiǎn)渭儼捳畈《鞠佘锗奏ぜっ?HSV-tk)或是可誘導(dǎo)半胱天冬酶9(iCasp9):由于自殺基因的導(dǎo)入,當(dāng)出現(xiàn)移植物抗宿主反應(yīng)時(shí),表達(dá)該自殺基因的效應(yīng)細(xì)胞能夠被自殺基因前體藥物,如更昔洛韋(GCV)或AP1903有效清除。因此,我們擬建立來(lái)自于健康供體的自殺基因調(diào)控的異基因免疫細(xì)胞(aSMKCs)庫(kù),對(duì)比觀察其對(duì)HCC和HCV感染的治療及預(yù)防作用。2.對(duì)HCC的治療研究：目前對(duì)于HCC的治療方式很多,但總體的療效仍不滿意,HCC的發(fā)病率和病死率仍居高不下,尋找新的有效的治療方式將可能為HCC的治療帶來(lái)新的希望。本課題擬通過(guò)體內(nèi)外等實(shí)驗(yàn),證實(shí)aSMKCs對(duì)肝癌的抑制作用,同時(shí),對(duì)于異基因反應(yīng)可能出現(xiàn)的主要毒副作用GvHD反應(yīng),利用自殺基因的導(dǎo)入可以快速安全的預(yù)防,從而為aSMKCs運(yùn)用于臨床治療HCC提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.預(yù)防HCV相關(guān)患者肝移植后的移植物HCV再感染：HCV感染最嚴(yán)重并發(fā)癥為肝硬化及HCC,肝移植是治療HCV相關(guān)并發(fā)癥的有效治療措施,然而,對(duì)于HCV患者來(lái)說(shuō),新移植物在移植后短期內(nèi)的HCV再感染仍是急需解決的棘手問(wèn)題。本課題將研究aSMKCs的各細(xì)胞亞型的細(xì)胞分泌功能及其在抗HCV再感染中的作用,為臨床治療HCV移植后再感染提供有效的治療和預(yù)防方式。[研究方法]1.完成aSMKCs細(xì)胞的生產(chǎn)：不同逆轉(zhuǎn)錄病毒上清的生產(chǎn),健康供體來(lái)源外周血細(xì)胞(PBMC)的提取、激活、轉(zhuǎn)染及擴(kuò)增；運(yùn)用流式細(xì)胞儀對(duì)aSMKCs進(jìn)行細(xì)胞亞型分類(lèi)；免疫磁珠分選法對(duì)aSMKCs細(xì)胞進(jìn)行陽(yáng)性篩選、凍存。2.建立HCC裸鼠原位模型：為更好的對(duì)HCC原位裸鼠模型進(jìn)行研究分析,選擇較理想的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法是后續(xù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵,因此,本課題運(yùn)用SCID、 Balb/c、NMRI-nu裸鼠對(duì)比研究經(jīng)肝臟注射、經(jīng)門(mén)靜脈注射和經(jīng)脾臟注射建立原位肝癌模型的死亡率、成功率,并用MRI結(jié)合BLI對(duì)比分析證實(shí)原位肝癌模型的建立,從而為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的真正原位模型提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.體外研究aSMKCs細(xì)胞毒活性：體外對(duì)比研究轉(zhuǎn)染自殺基因HSV-tk的aSMKCs及對(duì)照組PBMC細(xì)胞對(duì)經(jīng)pCLNCX穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa, Huh7細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)研究,設(shè)置不同濃度和時(shí)間段,觀察不同細(xì)胞因子激活擴(kuò)增的aSMKCs的體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)。觀察自殺基因的轉(zhuǎn)染對(duì)aSMKCs細(xì)胞毒作用的影響及其前體藥物在體外對(duì)aSMKCs的凋亡誘導(dǎo)作用。4.研究aSMKCs前體藥物對(duì)GvHD的預(yù)防作用：對(duì)比研究aSMKCs在皮下及原位HCC裸鼠模型的抗腫瘤作用,并觀察自殺基因前體藥物的使用對(duì)可能出現(xiàn)的移植物抗宿主反應(yīng)的預(yù)防作用,同時(shí)研究aSMKCs的抗HCC作用對(duì)免疫抑制劑的抵抗作用。5.建立HCV體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停簽檠芯勘磉_(dá)自殺基因的異基因免疫細(xì)胞對(duì)HCV的病毒復(fù)制抑制作用,我們運(yùn)用JFH1ΔE1E2-luc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7.5.1細(xì)胞建立HCV復(fù)制系統(tǒng),同時(shí)運(yùn)用和HCVC c-Jc-1建立HCV陽(yáng)性細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng),對(duì)比研究aSMKCs細(xì)胞體外對(duì)HCV病毒復(fù)制及生產(chǎn)的作用,從而為臨床上治療或預(yù)防HCV相關(guān)肝移植患者術(shù)后再感染提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。6.體外研究aSMKCs對(duì)HCV的抑制作用機(jī)制：體外研究aSMKCs對(duì)HCV復(fù)制系統(tǒng)和細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)HCV病毒生產(chǎn)的抑制作用,運(yùn)用單克隆抗體檢測(cè)其病毒抑制作用的機(jī)制,并觀測(cè)免疫抑制劑對(duì)該作用的影響。[研究結(jié)果]1.運(yùn)用MP71-T34FT質(zhì)粒和SFG.iCasp9.2A. Δ CD19質(zhì)粒,成功生產(chǎn)表達(dá)HSV-tk/CD34和iCasp9/CD19逆轉(zhuǎn)錄病毒上清并成功轉(zhuǎn)染PBMC,免疫磁珠陽(yáng)性篩選可提高aSMKCs的效應(yīng)細(xì)胞純度,免疫磁珠篩選前后的aSMKCs比例分別為9.1±0.8%和89.4±1.2%,其中T細(xì)胞、NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞轉(zhuǎn)染前分別為65.5+/-1.8,7.2+/-1.1,11.2+/-1.0,轉(zhuǎn)染后為77.3+/-3.2,11.1+/-1.6,5.3+／-2.0(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差),建立表達(dá)不同自殺基因的異基因免疫殺傷細(xì)胞細(xì)胞庫(kù)。2. aSMKCs對(duì)自殺基因前體藥物的敏感性：對(duì)比自殺基因前體藥物的運(yùn)用對(duì)aSMKCs細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用,(1μg/ml)GCV對(duì)HSV-tk/CD34+和(10nM)CID對(duì)CD19/iCasp9+aSMKCs的抑制率分別為92.5%和95%,而對(duì)PBMC無(wú)明顯作用。3.三種不同方式IPT(經(jīng)門(mén)靜脈注射)、IS(經(jīng)脾注射)和m(經(jīng)肝葉注射)在裸鼠體內(nèi)建立原位HCC模型的死亡率：手術(shù)中(D。)分別為16%,6%和3%,p0.05。術(shù)后死亡率三組分別為25%,3%and 2%, P0.01,而IS組和IH組在術(shù)后死亡率無(wú)明顯差異(3% vs 2%,p0.05)。通過(guò)MRI和BLI對(duì)原位HCC的分析,IH、IS和IPT的有效建立原位HCC模型的比例分別為52%vs 32%vs 19%,p0.05。4. aSMKCs體外具有明顯抗HCC作用,自殺基因的轉(zhuǎn)染對(duì)aSMKCs的異基因細(xì)胞毒活性無(wú)影響,其抗HCC作用為非MHC-I類(lèi)分子限制性,主要的效應(yīng)細(xì)胞為NKT細(xì)胞和NK細(xì)胞,免疫抑制劑對(duì)aSMKCs細(xì)胞毒活性無(wú)明顯影響,aSMKCs可以為自殺基因前體藥物快速誘導(dǎo)消除以預(yù)防GvHD。5.體內(nèi)研究表明,轉(zhuǎn)染了自殺基因的aSMKCs細(xì)胞體內(nèi)有明顯趨肝性,在HCC皮下和原位模型均具有明顯抗HCC作用,病理學(xué)證實(shí)其主要效應(yīng)細(xì)胞為NKT和NK細(xì)胞,其抗HCC的作用不受免疫抑制劑影響。自殺基因前體藥物可體內(nèi)快速消除表達(dá)自殺基因的aSMKCs細(xì)胞,從而安全有效預(yù)防GvHD作用。6,運(yùn)用HCV復(fù)制系統(tǒng)和HCVcc系統(tǒng)證實(shí),aSMKCs細(xì)胞在體外有明顯抗HCV復(fù)制及病毒生產(chǎn)的作用,其作用的發(fā)揮依賴IL-2,主要效應(yīng)細(xì)胞為NKT細(xì)胞和NK細(xì)胞,其作用的發(fā)揮通過(guò)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN-γ,而IFN-α或IFN-β則無(wú)明顯抗HCV作用,aSMKCs細(xì)胞抗HCV作用可拮抗免疫抑制劑,自殺基因前體藥物可快速消除aSMKCs而發(fā)揮預(yù)防GvHD作用,表達(dá)iCasp9自殺基因系統(tǒng)的aSMKCs其消除在體外明顯快于表達(dá)HSV-tk系統(tǒng),表現(xiàn)出更好的安全性。[研究結(jié)論]1.運(yùn)用不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,可以建立來(lái)源于健康供體的表達(dá)自殺基因的異基因免疫殺傷細(xì)胞庫(kù)(aSMKCs),可為臨床治療包括HCC在內(nèi)的實(shí)體腫瘤和預(yù)防HCV感染提高實(shí)驗(yàn)及理論基礎(chǔ)。2. aSMKCs在體外有明顯的抗腫瘤作用,與對(duì)照組相比,自殺基因的導(dǎo)入對(duì)異基因免疫細(xì)胞的細(xì)胞毒作用無(wú)明顯影響；3.通過(guò)三種不同方式的對(duì)比,經(jīng)肝臟注射是建立裸鼠原位肝癌模型的最佳方式,具有低死亡率及HCC模型成瘤率,但其成瘤部位相對(duì)局限；根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?選擇合適的HCC裸鼠原位模型是非常有必要的。4. aSMKCs在體內(nèi)有明顯的抗HCC的作用,且該作用的發(fā)揮呈IL-2依賴,其抗腫瘤作用及不受免疫抑制劑的影響,抗腫瘤的主要效應(yīng)細(xì)胞為NK及NKT細(xì)胞。5. aSMKCs在體外有明顯抑制HCV復(fù)制和生產(chǎn)的作用,其作用的發(fā)揮亦呈IL-2依賴,并主要通過(guò)NK及NKT細(xì)胞分泌的IFN,該作用可拮抗目前常用的免疫抑制劑。6.自殺基因的前體藥物能夠誘導(dǎo)表達(dá)自殺基因的aSMKCs效應(yīng)細(xì)胞凋亡,其中iCasp/9-CID自殺基因的誘導(dǎo)時(shí)間明顯快于HSV-tk-GCV系統(tǒng),從而能更有效預(yù)防移植物抗宿主反應(yīng)的發(fā)生
【關(guān)鍵詞】：過(guò)繼免疫治療 肝細(xì)胞癌 自殺基因 丙型肝炎
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7;R512.63
【目錄】：

• 英文縮寫(xiě)一覽表5-8
• 中文摘要8-13
• Abstract13-19
• 引言19-23
• 參考文獻(xiàn)21-23
• 第一部分：自殺基因修飾的異基因免疫殺傷細(xì)胞庫(kù)的分析研究及建立23-42
• 前言23-25
• 材料和方法25-29
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料25-26
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法26-29
• 結(jié)果29-37
• 討論37-39
• 結(jié)論39
• 參考文獻(xiàn)39-42
• 第二部分：自殺基因調(diào)節(jié)異基因免疫細(xì)胞對(duì)HCC治療的亞臨床研究42-72
• 前言42-45
• 材料和方法45-50
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料45-46
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法46-50
• 結(jié)果50-64
• 討論64-68
• 結(jié)論68
• 參考文獻(xiàn)68-72
• 第三部分：自殺基因修飾異基因免疫殺傷細(xì)胞抗HCV病毒的亞臨床研究72-88
• 前言72-74
• 材料和方法74-76
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料74-76
• 結(jié)果76-84
• 討論84-86
• 結(jié)論86
• 參考文獻(xiàn)86-88
• 全文結(jié)論88-89
• 文獻(xiàn)綜述 T細(xì)胞為基礎(chǔ)的過(guò)繼細(xì)胞轉(zhuǎn)化和免疫檢測(cè)點(diǎn)抑制在免疫治療中的運(yùn)用89-100
• 參考文獻(xiàn)97-100
• 致謝100

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 ;Autologous cytokine-induced killer cell therapy in clinical trial phase I is safe in patients with primary hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2004年08期

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本文編號(hào)：874276