本文關(guān)鍵詞：MicroRNA-34a在非酒精性脂肪性肝病中的作用及機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 非酒精性脂肪性肝病 miR-34a PPARα 脂質(zhì)代謝 AMPKⅣ

【摘要】：背景與目的： 近年來(lái)隨著人們生活水平的提高,非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)的患病率逐年增加,成為常見(jiàn)的慢性肝病之一。而NAFLD發(fā)生發(fā)展機(jī)制目前尚未完全明確。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),微小RNA (microRNA, miRNA)與肝臟疾病關(guān)系密切,我們前期發(fā)現(xiàn)miR-34a在兩種NAFLD模型肝臟中表達(dá)均顯著上調(diào),提示miR-34a可能在NAFLD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。發(fā)掘并分析miR-34a的作用靶標(biāo),對(duì)于揭示該miRNA的具體調(diào)節(jié)機(jī)制有著重要的作用。本研究以定量PCR (qPCR)的方法驗(yàn)證了miR-34a在NAFLD細(xì)胞和小鼠模型中的表達(dá)情況,并采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)研究miR-34a在NAFLD中的生物學(xué)功能。同時(shí),對(duì)所預(yù)測(cè)的miR-34a作用靶點(diǎn)PPARa進(jìn)行驗(yàn)證。 方法： 1、采用游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)誘導(dǎo)L02細(xì)胞建立NAFLD細(xì)胞模型,用高脂飲食(high fat diet, HFD)喂養(yǎng)C57BL/6小鼠構(gòu)建NAFLD動(dòng)物模型,采用qPCR法測(cè)定miR-34a在L02細(xì)胞及C57BL/6小鼠肝臟中的表達(dá)變化； 2、通過(guò)體外轉(zhuǎn)染niR-34a inhibitor或小鼠尾靜脈注射miR-34a基因敲減慢病毒載體的方式來(lái)進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)。以油紅O染色、HE染色、生化分析探討miR-34a表達(dá)抑制對(duì)脂變及炎癥程度的影響； 3、結(jié)合在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行miR-34a靶基因的預(yù)測(cè),并利用Western blot等進(jìn)行靶蛋白表達(dá)量的驗(yàn)證,同時(shí)利用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)對(duì)miR-34a的作用靶序列進(jìn)行鑒定。進(jìn)一步運(yùn)用Western blot、 qPCR等方法觀察miR-34a表達(dá)變化后其靶標(biāo)基因PPARa下游脂變相關(guān)基因的表達(dá)變化； 4、進(jìn)一步運(yùn)用PPARa siRNA探討PPARa表達(dá)抑制對(duì)離體肝細(xì)胞脂變程度的影響,運(yùn)用Western blot. qPCR等方法觀察PPARa表達(dá)變化后其下游脂變相關(guān)基因的表達(dá)變化。 結(jié)果： 1、在NAFLD細(xì)胞和小鼠肝組織中miR-34a的表達(dá)水平顯著上調(diào)； 2、通過(guò)對(duì)L02細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor或小鼠尾靜脈注射miR-34a基因敲減慢病毒載體抑制miR-34a的表達(dá),L02細(xì)胞胞漿及肝臟組織中脂滴沉積的程度得到顯著改善,甘油三酯的含量明顯下降,小鼠肝重/體重比值顯著下降,小鼠血清中AST水平顯著降低； 3、采用在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)PPARa是miR-34a可能的調(diào)控靶基因。我們?cè)贚02細(xì)胞及C57BL/6小鼠中檢測(cè)到PPARa在miR-34a表達(dá)抑制后其基因及蛋白水平均有上調(diào)。進(jìn)一步熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析證實(shí)PPARa是miR-34a的直接作用靶點(diǎn),其3’-UTR中存在miR-34a調(diào)控的作用序列. PPARa的下游脂變相關(guān)基因的表達(dá)隨著PPARa的改變而改變。另外,通過(guò)抑制miR-34a的表達(dá)后,可以激活能量代謝通路上關(guān)鍵蛋白AMPK的表達(dá)； 4、通過(guò)對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染PPARa siRNA抑制細(xì)胞中PPARa的表達(dá),可以使細(xì)胞胞漿中脂滴沉積的程度明顯加重,甘油三酯的含量也顯著升高,PPARa的下游脂變相關(guān)基因的表達(dá)隨著PPARa的改變而改變。 結(jié)論： miR-34a的表達(dá)與NAFLD密切相關(guān),miR-34a的表達(dá)上調(diào)參與NAFLD的脂質(zhì)代謝過(guò)程,miR-34a可能通過(guò)靶向PPARa成為NAFLD的潛在治療靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：非酒精性脂肪性肝病 miR-34a PPARα 脂質(zhì)代謝 AMPKⅣ
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R575
【目錄】：

• 致謝5-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-12
• 英文縮寫詞對(duì)照表12-16
• 1 引言16-22
• 1.1 miRNA簡(jiǎn)介16-17
• 1.2 miRNA的生物合成和功能17-18
• 1.3 miRNA在NAFLD中的意義18-20
• 1.4 miR-34a與NAFLD20-22
• 2 miR-34a在NAFLD模型中的表達(dá)情況22-38
• 2.1 前言22-23
• 2.2 材料與方法23-31
• 2.3 結(jié)果31-35
• 2.4 討論35-37
• 2.5 結(jié)論37-38
• 3 miR-34a對(duì)L02胞和C57BL/6小鼠肝臟脂變及炎癥的影響38-59
• 3.1 前言38-39
• 3.2 材料與方法39-49
• 3.3 結(jié)果49-56
• 3.4 討論56-58
• 3.5 結(jié)論58-59
• 4 miR-34a的靶基因及影響NAFLD的分子機(jī)制探討59-88
• 4.1 前言59-60
• 4.2 材料與方法60-73
• 4.3 結(jié)果73-84
• 4.4 討論84-86
• 4.5 結(jié)論86-88
• 5 總結(jié)與展望88-89
• 6 參考文獻(xiàn)89-95
• 綜述95-112
• 摘要95
• abstract95-106
• 5 參考文獻(xiàn)106-112
• 作者簡(jiǎn)歷及在學(xué)期間參與課題和發(fā)表論文11

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 ;非酒精性脂肪性肝病診療指南[J];中華肝臟病雜志;2006年03期

2 Serkan Dogan;Gokmen Zararsiz;Sebnem Gursoy;Kadri Guven;Omer Ozbakir;Munis Dundar;Mehmet Yucesoy;;Circulating microRNAs in patients with non-alcoholic fatty liver disease[J];World Journal of Hepatology;2014年08期

3 Glenn S Gerhard;Johanna K DiStefano;;Micro RNAs in the development of non-alcoholic fatty liver disease[J];World Journal of Hepatology;2015年02期

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本文編號(hào)：849689