本文關(guān)鍵詞：角蛋白1轉(zhuǎn)基因小鼠建系及其在小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎中的作用研究

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【摘要】：[背景]潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis, UC)是一種腸道慢性非特異性炎癥性疾病。病變多起自直腸,逐漸向近端發(fā)展,并可累及全結(jié)腸。癥狀反復(fù)發(fā)作、遷延不愈,給患者的生活帶來(lái)巨大影響。目前其確切的病因、發(fā)病機(jī)制仍不明確。本課題組前期通過(guò)基因芯片、雙向凝膠電泳及質(zhì)譜分析等系列研究篩選出UC患者差異表達(dá)的基因和蛋白質(zhì),發(fā)現(xiàn)角蛋白1(Keratin 1,KRT1)在基因及蛋白水平均表達(dá)下調(diào),隨后免疫組化結(jié)果也證實(shí)KRT1在UC患者腸黏膜中表達(dá)減少,且與疾病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān),但至今KRT1在UC發(fā)生發(fā)展中的具體機(jī)制仍不明確。本研究擬采用轉(zhuǎn)基因小鼠DSS腸炎模型探討KRT1與UC炎癥的關(guān)系,以期初步闡明KRT1在UC中的作用。[目的]建立KRT1雜合子轉(zhuǎn)基因小鼠,構(gòu)建葡聚糖硫酸鈉(Dextran sodium sulfate, DSS)誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型,從動(dòng)物水平探討KRT1對(duì)UC炎癥的影響。[方法]1、KRT1轉(zhuǎn)基因小鼠建系：采用DNA原核顯微注射的方法構(gòu)建KRT1轉(zhuǎn)基因小鼠,采用經(jīng)典育種與PCR相結(jié)合的方法對(duì)轉(zhuǎn)基因(Transgenic mice, TG)小鼠進(jìn)行篩選,建立KRT1雜合子轉(zhuǎn)基因小鼠。2、分組：選擇7-8周雄性C57BL/6野生型(Wild-type,WT)小鼠及KRT1雜合子轉(zhuǎn)基因小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,隨機(jī)分組為KRT1轉(zhuǎn)基因小鼠模型組(TG DSS)、野生型小鼠模型組(WT DSS)、KRT1轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)照組(TG control)、野生型小鼠對(duì)照組(WT control),每組15只。3、模型構(gòu)建：模型組小鼠自實(shí)驗(yàn)第一天凌晨開(kāi)始自由飲用4%DSS,對(duì)照組小鼠同一時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始自由飲用高壓滅菌蒸餾水,實(shí)驗(yàn)第八天上午乙醚麻醉后頸椎脫臼法處死各實(shí)驗(yàn)組小鼠。4、觀察實(shí)驗(yàn)過(guò)程中小鼠精神、飲食、體重及疾病活動(dòng)指數(shù)變化。5、對(duì)比各實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸及脾臟長(zhǎng)度、重量、大體形態(tài)改變及病理學(xué)評(píng)分。ELISA法檢測(cè)結(jié)腸組織勻漿中腫瘤壞死因子-a(Tumor necrosis factor-a, TNF-a)及白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)的表達(dá)水平。[結(jié)果]1、運(yùn)用DNA原核顯微注射的方法成功構(gòu)建KRT1轉(zhuǎn)基因小鼠。采用經(jīng)典育種與PCR相結(jié)合的方法鑒定出KRT1轉(zhuǎn)基因小鼠。采用F3代KRT1轉(zhuǎn)基因小鼠與非轉(zhuǎn)基因小鼠交配,鑒定出陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠作為KRT1雜合子序列轉(zhuǎn)基因小鼠用于研究。2、運(yùn)用4%DSS成功誘導(dǎo)出小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型；3、TG DSS組小鼠較TG control組小鼠體重下降明顯(5.7214±-0.66375 vs-0.6200±0.50775, P0.05)。WT DSS組小鼠體重下降較WT control組小鼠明顯(4.7700±0.64611 vs-0.7464±0.99117,P0.05)。且模型組中TG DSS組小鼠體重下降較WT DSS組小鼠更為顯著(5.7214±0.66375 vs4.7700±0.64611,P0.05)。4、TG DSS組小鼠DAI評(píng)分顯著高于TG control組(3.9080±0.19713 vs0.0000±0.00000, P0.05), WT DSS組小鼠DAI評(píng)分亦顯著高于WT control組(3.8222±0.24774 vs 0.0222±0.08607,P0.05)。且模型組中TG DSS組小鼠DAI評(píng)分升高較WT DSS組小鼠更為明顯,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(3.9080±0.19713 vs3.8222±0.24774,P0.05)。對(duì)照組中轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠DAI評(píng)分無(wú)顯著差異(P0.05)。5、TG DSS組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度較TG control組小鼠明顯縮短(4.2571±0.35673 vs7.3800±0.54668,P0.05),重量明顯減輕(0.2193±0.03174 vs 0.3080±0.01146,P0.05)。野生型小鼠中WT DSS組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度較WT control組小鼠明顯縮短(4.5800±0.56467 vs 7.2333±0.56653,P0.05),重量明顯減輕(0.2513±0.03623 vs0.2973±0.03305,P0.05)。模型組中TG DSS組小鼠結(jié)腸重量下降較WT DSS組更為顯著(0.2193±0.03174 vs 0.2513±0.03623,P0.05),結(jié)腸長(zhǎng)度亦較WT DSS組縮短,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(4.2571±0.35673 vs 4.5800±0.56467,P0.05)。對(duì)照組中TG control組與WT control組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度及重量均無(wú)明顯差異(P0.05)。6. TG DSS組小鼠脾臟重量較TG control組小鼠明顯增加(0.1100±0.03162 vs0.0667±0.01113,P0.05)。WT DSS組小鼠脾臟重量較WT control組小鼠明顯增加(0.0887±0.02532 vs 0.0573±0.01580,P0.05)。TG DSS組小鼠脾臟重量亦較WT DSS組小鼠增高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.1100±0.03162 vs 0.0887±0.02532,P0.05)。7、模型組結(jié)腸可見(jiàn)充血、出血,與對(duì)照組相比結(jié)腸明顯水腫、增厚。TG DSS組小鼠結(jié)腸炎癥大體形態(tài)評(píng)分顯著高于TG control組(2.7143±0.46881 vs0.0000±0.00000, P0.05)。WT DSS組小鼠結(jié)腸炎癥大體形態(tài)評(píng)分也顯著高于WT control組(2.5333±0.51640 vs 0.0000±0.00000,P0.05)。分別進(jìn)行模型組及對(duì)照組組內(nèi)比較,結(jié)果提示轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠結(jié)腸炎癥大體形態(tài)評(píng)分無(wú)顯著差異(P0.05)。HE染色觀察可見(jiàn)模型組小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸上皮部分缺失、隱窩結(jié)構(gòu)破壞,大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)至黏膜下層,TG DSS組小鼠病理學(xué)評(píng)分顯著高于TG control組小鼠(11.8667±0.83381 vs 3.0000±0.37796,P0.05)。WT DSS組小鼠病理學(xué)評(píng)分亦顯著高于WT control組(9.7333±1.79151 vs 0.0000±0.00000,P0.05)。且TG DSS組小鼠病理學(xué)評(píng)分較WT DSS組小鼠明顯增高(11.8667±0.83381 vs 9.7333±1.79151, P0.05)。TG control組可見(jiàn)小鼠結(jié)腸黏膜層散在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),隱窩及結(jié)腸上皮結(jié)構(gòu)正常。TG control組病理學(xué)評(píng)分明顯高于WT control組(P0.05)。8、TG DSS組小鼠結(jié)腸組織TNF-α、IL-1β濃度均顯著高于TG control組(84.7236±33.2125 vs 31.8401±3.8448, P0.05), (56.2919±22.2126 vs 16.0534±1.8604, P0.05)。WT DSS組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β濃度也較WT control組明顯升高(63.5450±19.5156 vs 35.2294±4.8557,P0.05), (42.3633±13.0104 vs 17.5480±2.4053,P0.05)。且TG DSS組小鼠結(jié)腸組織TNF-α、IL-1β表達(dá)升高較WT DSS組小鼠更為明顯(P0.05)。[結(jié)論]1、成功構(gòu)建KRT1轉(zhuǎn)基因小鼠,獲得穩(wěn)定的雜合子序列；2、4%DSS可成功建立小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型；3、KRT1轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎具有更高的敏感性；4、KRT1基因編碼序列,蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能異�？杉又谼SS誘導(dǎo)的腸道炎癥,部分揭示KRT1在UC發(fā)病機(jī)制中的作用。
【關(guān)鍵詞】：角蛋白1 轉(zhuǎn)基因小鼠 DSS腸炎模型 潰瘍性結(jié)腸炎 發(fā)病機(jī)制
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R574.62
【目錄】：

• 縮略詞表(以字母順序排列)5-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-17
• 材料與方法17-28
• 結(jié)果28-38
• 討論38-42
• 結(jié)論42-43
• 參考文獻(xiàn)43-51
• 附錄51-61
• 綜述61-73
• 參考文獻(xiàn)68-73
• 攻讀學(xué)位期間獲得的學(xué)術(shù)成果73-74
• 致謝74

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9 賈永林;賈延R，

本文編號(hào)：849615