本文關鍵詞：角蛋白1轉基因小鼠建系及其在小鼠實驗性結腸炎中的作用研究

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【摘要】：[背景]潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis, UC)是一種腸道慢性非特異性炎癥性疾病。病變多起自直腸,逐漸向近端發(fā)展,并可累及全結腸。癥狀反復發(fā)作、遷延不愈,給患者的生活帶來巨大影響。目前其確切的病因、發(fā)病機制仍不明確。本課題組前期通過基因芯片、雙向凝膠電泳及質譜分析等系列研究篩選出UC患者差異表達的基因和蛋白質,發(fā)現(xiàn)角蛋白1(Keratin 1,KRT1)在基因及蛋白水平均表達下調(diào),隨后免疫組化結果也證實KRT1在UC患者腸黏膜中表達減少,且與疾病嚴重程度呈負相關,但至今KRT1在UC發(fā)生發(fā)展中的具體機制仍不明確。本研究擬采用轉基因小鼠DSS腸炎模型探討KRT1與UC炎癥的關系,以期初步闡明KRT1在UC中的作用。[目的]建立KRT1雜合子轉基因小鼠,構建葡聚糖硫酸鈉(Dextran sodium sulfate, DSS)誘導的小鼠實驗性結腸炎模型,從動物水平探討KRT1對UC炎癥的影響。[方法]1、KRT1轉基因小鼠建系：采用DNA原核顯微注射的方法構建KRT1轉基因小鼠,采用經(jīng)典育種與PCR相結合的方法對轉基因(Transgenic mice, TG)小鼠進行篩選,建立KRT1雜合子轉基因小鼠。2、分組：選擇7-8周雄性C57BL/6野生型(Wild-type,WT)小鼠及KRT1雜合子轉基因小鼠作為實驗動物,隨機分組為KRT1轉基因小鼠模型組(TG DSS)、野生型小鼠模型組(WT DSS)、KRT1轉基因小鼠對照組(TG control)、野生型小鼠對照組(WT control),每組15只。3、模型構建：模型組小鼠自實驗第一天凌晨開始自由飲用4%DSS,對照組小鼠同一時間點開始自由飲用高壓滅菌蒸餾水,實驗第八天上午乙醚麻醉后頸椎脫臼法處死各實驗組小鼠。4、觀察實驗過程中小鼠精神、飲食、體重及疾病活動指數(shù)變化。5、對比各實驗組小鼠結腸及脾臟長度、重量、大體形態(tài)改變及病理學評分。ELISA法檢測結腸組織勻漿中腫瘤壞死因子-a(Tumor necrosis factor-a, TNF-a)及白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)的表達水平。[結果]1、運用DNA原核顯微注射的方法成功構建KRT1轉基因小鼠。采用經(jīng)典育種與PCR相結合的方法鑒定出KRT1轉基因小鼠。采用F3代KRT1轉基因小鼠與非轉基因小鼠交配,鑒定出陽性轉基因小鼠作為KRT1雜合子序列轉基因小鼠用于研究。2、運用4%DSS成功誘導出小鼠實驗性結腸炎模型；3、TG DSS組小鼠較TG control組小鼠體重下降明顯(5.7214±-0.66375 vs-0.6200±0.50775, P0.05)。WT DSS組小鼠體重下降較WT control組小鼠明顯(4.7700±0.64611 vs-0.7464±0.99117,P0.05)。且模型組中TG DSS組小鼠體重下降較WT DSS組小鼠更為顯著(5.7214±0.66375 vs4.7700±0.64611,P0.05)。4、TG DSS組小鼠DAI評分顯著高于TG control組(3.9080±0.19713 vs0.0000±0.00000, P0.05), WT DSS組小鼠DAI評分亦顯著高于WT control組(3.8222±0.24774 vs 0.0222±0.08607,P0.05)。且模型組中TG DSS組小鼠DAI評分升高較WT DSS組小鼠更為明顯,但差異無統(tǒng)計學意義(3.9080±0.19713 vs3.8222±0.24774,P0.05)。對照組中轉基因小鼠與野生型小鼠DAI評分無顯著差異(P0.05)。5、TG DSS組小鼠結腸長度較TG control組小鼠明顯縮短(4.2571±0.35673 vs7.3800±0.54668,P0.05),重量明顯減輕(0.2193±0.03174 vs 0.3080±0.01146,P0.05)。野生型小鼠中WT DSS組小鼠結腸長度較WT control組小鼠明顯縮短(4.5800±0.56467 vs 7.2333±0.56653,P0.05),重量明顯減輕(0.2513±0.03623 vs0.2973±0.03305,P0.05)。模型組中TG DSS組小鼠結腸重量下降較WT DSS組更為顯著(0.2193±0.03174 vs 0.2513±0.03623,P0.05),結腸長度亦較WT DSS組縮短,但差異無統(tǒng)計學意義(4.2571±0.35673 vs 4.5800±0.56467,P0.05)。對照組中TG control組與WT control組小鼠結腸長度及重量均無明顯差異(P0.05)。6. TG DSS組小鼠脾臟重量較TG control組小鼠明顯增加(0.1100±0.03162 vs0.0667±0.01113,P0.05)。WT DSS組小鼠脾臟重量較WT control組小鼠明顯增加(0.0887±0.02532 vs 0.0573±0.01580,P0.05)。TG DSS組小鼠脾臟重量亦較WT DSS組小鼠增高,但差異無統(tǒng)計學意義(0.1100±0.03162 vs 0.0887±0.02532,P0.05)。7、模型組結腸可見充血、出血,與對照組相比結腸明顯水腫、增厚。TG DSS組小鼠結腸炎癥大體形態(tài)評分顯著高于TG control組(2.7143±0.46881 vs0.0000±0.00000, P0.05)。WT DSS組小鼠結腸炎癥大體形態(tài)評分也顯著高于WT control組(2.5333±0.51640 vs 0.0000±0.00000,P0.05)。分別進行模型組及對照組組內(nèi)比較,結果提示轉基因小鼠與野生型小鼠結腸炎癥大體形態(tài)評分無顯著差異(P0.05)。HE染色觀察可見模型組小鼠遠端結腸上皮部分缺失、隱窩結構破壞,大量炎癥細胞浸潤至黏膜下層,TG DSS組小鼠病理學評分顯著高于TG control組小鼠(11.8667±0.83381 vs 3.0000±0.37796,P0.05)。WT DSS組小鼠病理學評分亦顯著高于WT control組(9.7333±1.79151 vs 0.0000±0.00000,P0.05)。且TG DSS組小鼠病理學評分較WT DSS組小鼠明顯增高(11.8667±0.83381 vs 9.7333±1.79151, P0.05)。TG control組可見小鼠結腸黏膜層散在炎癥細胞浸潤,隱窩及結腸上皮結構正常。TG control組病理學評分明顯高于WT control組(P0.05)。8、TG DSS組小鼠結腸組織TNF-α、IL-1β濃度均顯著高于TG control組(84.7236±33.2125 vs 31.8401±3.8448, P0.05), (56.2919±22.2126 vs 16.0534±1.8604, P0.05)。WT DSS組小鼠結腸組織中TNF-α、IL-1β濃度也較WT control組明顯升高(63.5450±19.5156 vs 35.2294±4.8557,P0.05), (42.3633±13.0104 vs 17.5480±2.4053,P0.05)。且TG DSS組小鼠結腸組織TNF-α、IL-1β表達升高較WT DSS組小鼠更為明顯(P0.05)。[結論]1、成功構建KRT1轉基因小鼠,獲得穩(wěn)定的雜合子序列；2、4%DSS可成功建立小鼠實驗性結腸炎模型；3、KRT1轉基因小鼠對DSS誘導的實驗性結腸炎具有更高的敏感性；4、KRT1基因編碼序列,蛋白質的結構或功能異�？杉又谼SS誘導的腸道炎癥,部分揭示KRT1在UC發(fā)病機制中的作用。
【關鍵詞】：角蛋白1 轉基因小鼠 DSS腸炎模型 潰瘍性結腸炎 發(fā)病機制
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R574.62
【目錄】：

• 縮略詞表(以字母順序排列)5-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-17
• 材料與方法17-28
• 結果28-38
• 討論38-42
• 結論42-43
• 參考文獻43-51
• 附錄51-61
• 綜述61-73
• 參考文獻68-73
• 攻讀學位期間獲得的學術成果73-74
• 致謝74

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