本文關鍵詞：TRPV4對大鼠HSC-T6細胞的作用探究

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【摘要】：肝纖維化(Hepatic fibrosis,HF)是肝臟對酒精、藥物、病毒感染、自身免疫失衡等細胞損傷因素而產生的一種可逆的愈合反應,為慢性肝病共有的病理改變,主要表現(xiàn)為以膠原為主的細胞外基質(extracellular matrix,ECM)在肝內大量沉積并伴有肝臟損傷,如果不加以控制,肝纖維化可發(fā)展為肝硬化甚至肝癌,嚴重威脅人類健康。探討肝纖維化形成過程中的機制對慢性肝病的治療具有重要的意義。肝星狀細胞(Hepatic stellate cells,HSCs)與肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程存在著密切的聯(lián)系,HSCs細胞的激活對肝纖維化的形成有著重要的作用。激活的HSCs細胞轉化形為肌成纖維細胞(Myofibroblast-like cells,MFBLC),并分泌大量的膠原,最終導致肝纖維的形成。作為肝纖維化發(fā)生的主要效應細胞之一,促進增殖的HSCs發(fā)生凋亡已成為防治肝纖維化有效途徑。大量研究證實,自噬(Autophagy)在肝纖維化形成過程中發(fā)揮著重要的作用,自噬與HSCs細胞的凋亡也存在密切的聯(lián)系。同時,研究表明,HSCs細胞的激活能夠促進細胞鈣離子(Ca2+)內流,抑制HSCs細胞Ca2+內流對促進活化的HSCs細胞發(fā)生凋亡具有重要的意義。并且,研究證實Ca2+濃度的變化對細胞自噬也起著重要的調節(jié)作用。課題組前期研究證實,非選擇性Ca2+瞬時感受器電位離子通道香草素受體亞家族4(Transient receptor potential vanilloid receptor 4,TRPV4)在肝纖維化形成中發(fā)揮著重要的作用。本課題重點研究TRPV4對大鼠HSC-T6的作用,為肝纖維化的治療提供新的靶點。主要研究內容概括如下:1.TRPV4在大鼠肝星狀細胞中的表達情況及對大鼠肝星狀細胞凋亡蛋白的影響實驗采用大鼠HSC-T6細胞系為研究對象,用濃度為10ng/ml TGF-?1處理細胞24h,實時定量PCR(qRT-PCR)、Western blot檢測TRPV4的mRNA和蛋白的表達水平,檢測結果顯示,與未處理組相比,TGF-?1處理后,TRPV4的mRNA和蛋白水平明顯升高。提示TRPV4在大鼠HSC-T6細胞中增殖、活化過程中可能發(fā)揮著重要的作用。采用lipofectaminetm2000介導的sirna技術特異性沉默大鼠hsc-t6細胞內trpv4,首先通過流式細胞技術觀察大鼠hsc-t6細胞凋亡情況,并采用qrt-pcr、westernblot檢測bax、caspase3mrna水平以及bax、pro-caspase3蛋白水平。qrt-pcr、westernblot結果顯示,與tgf-?1處理組相比,特異性阻斷trpv4的表達,可明顯提高bax、caspase3mrna水平以及bax、pro-caspase3蛋白水平。流式結果顯示,與tgf-?1處理組相比,特異性阻斷trpv4的表達,可明顯促進大鼠hsc-t6細胞凋亡蛋白的表達。與之相應的,通過trpv4的特異性激動劑1um4α-pdd激活trpv4,qrt-pcr、westernblot檢測結果顯示,與tgf-?1處理組相比,bax、caspase3mrna水平以及bax、pro-caspase3蛋白水平明顯下降。提示,在細胞活化的過程中,trpv4可以抑制凋亡蛋白的表達,可能起到調控細胞凋亡的作用。2.自噬在大鼠hsc-t6細胞中的水平及trpv4對自噬水平的影響機制研究qrt-pcr、westernblot檢測顯示,與未處理組相比,tgf-?1處理后,lc3的mrna和蛋白水平明顯升高,p62的mrna和蛋白水平明顯降低。特異性阻斷trpv4,qrt-pcr、westernblot檢測結果顯示,與tgf-?1處理組相比,lc3的mrna和蛋白水平明顯降低,p62的mrna和蛋白水平明顯升高,吖啶橙染色結果顯示,自噬小泡明顯減少。激活trpv4后,qrt-pcr、westernblot檢測結果顯示,與tgf-?1處理組相比,lc3的mrna和蛋白水平明顯升高,p62的mrna和蛋白水平明顯降低,吖啶橙染色結果顯示,自噬小泡明顯減少。為了進一步研究trpv4對自噬的調節(jié)機制,大量文獻證實,akt通路是自噬的經典上游通路。通過特異性阻斷trpv4,westernblot檢測結果顯示,與tgf-?1處理組相比,p-akt蛋白表達水平明顯降低。以上結果提示,在細胞活化的過程中,trpv4可能是通過激活akt通路繼而上調自噬。3.在大鼠hsc-t6細胞中自噬對凋亡蛋白表達的影響使用自噬抑制劑氯喹抑制自噬的水平,qrt-pcr、westernblot檢測結果顯示,與tgf-?1處理組相比,bax、caspase3mrna水平以及bax、pro-caspase3蛋白水平明顯升高。提示在大鼠hsc-t6細胞中,抑制自噬水平可明顯促進凋亡蛋白的表達。為了進一步探討TRPV4與自噬和凋亡蛋白變化之間的關系。我們發(fā)現(xiàn),在抑制自噬的基礎上激活TRPV4,與TRPV4不處理組比較,凋亡蛋白沒有明顯的變化。證實TRPV4可能是通過激活自噬進而抑制凋亡凋亡蛋白的表達。
【關鍵詞】：瞬時受體電位V4通道 肝星狀細胞 自噬 凋亡蛋白 AKT信號通路
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R575.2
【目錄】：

• 中英文縮略詞對照7-9
• 中文摘要9-12
• Abstract12-15
• 1. 前言15-17
• 2. 實驗材料17-21
• 2.1 藥品與試劑17-18
• 2.2 儀器與設備18-19
• 2.3 溶液和試劑的配制19-21
• 3. 實驗方法21-31
• 3.1 細胞培養(yǎng)21-22
• 3.1.1 細胞復蘇21
• 3.1.2 細胞培養(yǎng)21
• 3.1.3 細胞傳代21-22
• 3.1.4 細胞計數(shù)22
• 3.1.5 細胞凍存22
• 3.2 細胞轉染22-23
• 3.3 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)23-26
• 3.3.1 HSC-T6細胞總RNA的提取23-24
• 3.3.2 cDNA的合成24-25
• 3.3.3 提取的細胞cDNA用于qRT-PCR25-26
• 3.4 MTT比色法測細胞增殖26
• 3.5 吖啶橙染色檢測細胞自噬26-27
• 3.6 流式細胞術檢測細胞細胞凋亡27
• 3.7 Western Blot27-30
• 3.7.1 細胞總蛋白制備和定量27
• 3.7.2 蛋白質電泳27-29
• 3.7.3 半干轉29
• 3.7.4 電轉移（濕轉）29
• 3.7.5 抗原抗體反應及顯色29-30
• 3.7.6 結果分析30
• 3.8 統(tǒng)計學分析30-31
• 4. 實驗結果31-53
• 4.1 TRPV4在TGF-β1誘導的HSC-T6細胞中的表達變化31-32
• 4.2 TRPV4對HSC-T6凋亡蛋白表達的影響32-40
• 4.2.1 轉染si-TRPV4后對HSC-T6凋亡蛋白表達的作用32-36
• 4.2.2 促進TRPV4表達對HSC-T6凋亡蛋白表達的影響36-40
• 4.3 自噬水平在TGF-β1誘導的HSC-T6細胞中的變化40-41
• 4.4 TRPV4對HSC-T6細胞自噬的作用41-46
• 4.4.1 轉染TRPV4 siRNA后對HSC-T6自噬水平的作用41-44
• 4.4.2 刺激TRPV4后對HSC-T6自噬的影響44-46
• 4.5 自噬對HSC-T6細胞凋亡蛋白表達的影響46-50
• 4.6 TRPV4通過調節(jié)自噬進而抑制凋亡的表達50-51
• 4.7 沉默TRPV4對HSC-T6細胞中p-AKT表達的影響51-53
• 5. 討論53-56
• 結論56-57
• 參考文獻57-62
• 附錄62-64
• 致謝64-65
• 綜述65-86
• References76-86

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 梁一晨;吳紅革;薛紅建;劉青;石亮亮;劉濤;伍鋼;;Effects of PI3K Inhibitor NVP-BKM120 on Acquired Resistance to Gefitinib of Human Lung Adenocarcinoma H1975 Cells[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2013年06期

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本文編號：848292