發(fā)布時(shí)間：2017-08-31 03:24

  本文關(guān)鍵詞：慢性HBV感染者外周血單個(gè)核細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的表達(dá)和乙肝慢性化關(guān)系

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【摘要】：[背景／目的]乙型肝炎病毒(HBV)非常容易造成感染的慢性化,但是其慢性化的發(fā)病機(jī)制機(jī)制目前還沒有完全研究清楚。近幾年來的研究成果表明,外周血淋巴細(xì)胞的凋亡和免疫耐受的發(fā)生與HBV感染的慢性化有密切的關(guān)系。活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(AICD)是指已經(jīng)激活的成熟淋巴細(xì)胞(T淋巴細(xì)胞或B淋巴細(xì)胞)在抗原呈遞細(xì)胞和細(xì)胞因子如IL-1、IL-2的輔助作用下被抗原性物質(zhì)或其他因素活化后,當(dāng)再一次受到激活信號(hào)(尤其是T細(xì)胞受體／CD3復(fù)合物等)刺激后分泌TNF等細(xì)胞因子或通過表達(dá)FasL等膜蛋白從而誘導(dǎo)自身所發(fā)生的細(xì)胞凋亡。外周血淋巴細(xì)胞通過激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡,不僅可以維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài),也可能是導(dǎo)致機(jī)體外周免疫耐受形成的重要因素。外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)即外周血中具有單個(gè)細(xì)胞核的細(xì)胞,主要由大量的淋巴細(xì)胞組成,除此之外還包括少量的自然殺傷細(xì)胞(NK)、單核巨噬細(xì)胞等各種免疫活性細(xì)胞,在機(jī)體對(duì)抗外來抗原的免疫反應(yīng)尤其是特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)中起重要作用。細(xì)胞凋亡是機(jī)體為了維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài),在各種細(xì)胞因子的共同參與和凋亡相關(guān)基因的嚴(yán)格調(diào)控下,發(fā)生的一系列有步驟的裂解過程,是一種生理性的細(xì)胞死亡。細(xì)胞的凋亡路徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的確切發(fā)生機(jī)制到目前為止還沒有完全搞清楚。根據(jù)起始激活的Caspase家族成員不同,細(xì)胞凋亡的激活途徑可以分為三種：第一種是死亡受體途徑,又稱為外源性途徑,通過FAS配體(FASLG)與FAS(CD95)的結(jié)合而觸發(fā)凋亡。FAS-FASL結(jié)合以后,通過一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng),導(dǎo)致凋亡蛋白酶8(CASP8)的激活,隨后活化的凋亡蛋白酶8又可以進(jìn)一步激活凋亡效應(yīng)器即凋亡蛋白酶3,凋亡蛋白酶6,凋亡蛋白酶7(CASP3, CASP6, CASP7),由凋亡效應(yīng)器執(zhí)行下面的凋亡過程。第二種是線粒體途徑, 又稱為內(nèi)源性途徑,在凋亡信號(hào)的刺激下,原本儲(chǔ)存在線粒體膜間隙的凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)、細(xì)胞色素C (CytC)等釋放出來到胞漿中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 在ATP/dATP存在的前提條件下,位于膜間隙中的大量CytC釋放處理進(jìn)入到胞漿,然后與Apaf-1形成多聚復(fù)合體,通過Apaf-1 N-末端的Caspase-募集結(jié)構(gòu)域(CARD)招募聚集胞質(zhì)中的caspase-9,并誘導(dǎo)其活化進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。第三種是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑,在應(yīng)激狀態(tài)下促使caspase-7由胞漿轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面,同時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)誘導(dǎo)caspase-12的表達(dá)增加。由Caspase-7進(jìn)一步激活caspase-12,而后者激活后又可進(jìn)一步剪切加工caspase3,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。本次研究的目的在于探討慢性HBV感染者PBMC中是否存在AICD現(xiàn)象, 外周血淋巴細(xì)胞不同的凋亡路徑,及其在HBV感染慢性化過程中作用。[方法]1.入選標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)：慢性HBV攜帶者9名,慢性乙型肝炎患者48名(其中輕度患者14例,中度患者22例,重度患者12例),肝硬化患者24名,所有入選患者的診斷符合2010年《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn),并排除甲、丙、丁和戊型肝炎及其他原因所致的肝損害。20例健康人為正常對(duì)照組。2.標(biāo)本采集：嚴(yán)格按照無菌操作的原則,采集空腹靜脈血7ml,加入EDTA抗凝。其中3ml離心(2000r/min,5min)獲得血漿,-80℃保存?zhèn)溆谩?ml新鮮全血用Ficoll密度梯度離心法提取PBMC,-80℃保存?zhèn)溆谩?.提取總RNA,測(cè)定RNA濃度和純度取出凍存的PBMC,室溫條件下解凍5min,然后加入lml Trizol,嚴(yán)格按照試劑盒說明書規(guī)范操作,提取總RNA,測(cè)定RNA濃度和純度,保證A260/A280在1.8~2.0。4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PBMC中FAS, CASP-8, CYCS, CASP-9, CASP-3的表達(dá)。5.采用“雙抗體一步夾心法”酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血漿中CASP-8, CASP-9, CASP-3的表達(dá)。[結(jié)果]1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示：CHB組和ASC組凋亡相關(guān)基因(FAS,Caspase-8, CYCS, Caspase-9, Caspase-3)的表達(dá)明顯高于NC組和LC組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),LC組高于NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而CHB組和ASC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2. ELISA結(jié)果顯示：血漿Caspase-9, Caspase-8, Caspase-3濃度由高到低依次為CHB組和ASC組LC組NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.0083), CHB組和ASC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.0083)。3. ELISA結(jié)果顯示：HBV-DNA陽性組血漿Caspase-9, Caspase-8, Caspase-3的濃度均明顯高于HBV-DNA陰性組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4. ELISA結(jié)果顯示：血漿Caspase-9, Caspase-8, Caspase-3濃度水平由高到低依次為：慢性乙肝(輕度)組慢性乙肝(中度)組慢性乙肝(重度)組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。[結(jié)論]HBV感染可以誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞的凋亡(即AICD),內(nèi)源性路徑(即線粒體途徑)和外源性路徑(死亡受體途徑)均參與其中,PBMC的凋亡在HBV感染慢性化過程中發(fā)揮了重要作用。
【關(guān)鍵詞】：慢性乙型肝炎 外周血單個(gè)核細(xì)胞 凋亡 凋亡相關(guān)基因 激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R512.62
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 符號(hào)說明12-14
• 前言14-18
• 材料與方法18-26
• 結(jié)果26-29
• 討論29-35
• 參考文獻(xiàn)35-40
• 致謝40-41
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文41-42
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表42

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1 陳芬;王瓊;;急性乙型病毒性肝炎慢性化影響因素研究[J];中國民康醫(yī)學(xué);2006年16期

2 曾愛萍;常潔;劉芳;邱蔚蔚;;丙型肝炎病毒感染慢性化進(jìn)程影響因素觀察[J];江蘇醫(yī)藥;2007年06期

3 王漧萬;媄惠風(fēng);余P沉，

本文編號(hào)：763194