發(fā)布時間：2017-08-29 04:18

  本文關(guān)鍵詞：熱休克轉(zhuǎn)錄因子2調(diào)控自噬在潰瘍性結(jié)腸炎中作用的研究

  更多相關(guān)文章： 潰瘍性結(jié)腸炎 HSF2 自噬 丁酸鈉 分子機制

【摘要】：[目的]潰瘍性結(jié)腸炎是炎癥性腸病的一個主要類型,屬于結(jié)、直腸粘膜的彌漫性炎癥。其臨床特點為原因不明的反復血便。目前尚無一個可明確的病因以及相應有效的內(nèi)科治療方法。由于潰瘍性結(jié)腸炎在臨床診斷和治療方面較為復雜,還沒有很明確的直接有效的藥物,世界衛(wèi)生組織認為潰瘍性結(jié)腸炎屬于難治愈的疾病之一。深入研究潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生的分子機制,尋找靶向治療或者有效的臨床緩解方案具有重要的臨床意義。已有的研究表明自噬在結(jié)、直腸炎癥中常常發(fā)生。而我們課題組前期的研究也發(fā)現(xiàn)HSF2在潰瘍性結(jié)腸炎患者中高表達。二者之間是否有聯(lián)系?是否能夠提供靶向治療的新思路?在本研究中,我們將對此做進一步驗證。研究將初步探索二者在潰瘍性結(jié)腸炎中的作用及可能的分子機制。[方法]1,收集診斷明確的潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜組織標本50例,采用HE染色明確UC的特征性病理表現(xiàn),免疫組化方法檢測患者與30例正常對照組腸黏膜組織中HSF2的表達情況,分析與臨床病例特征的關(guān)系。透射電鏡觀察各組組織中自噬泡和自噬小體的數(shù)量。通過熒光定量和Western blot方法檢測自噬標志物LC3Ⅱ的表達水平。2,利用不同濃度的丁酸鈉誘導HT29細胞自噬,觀察HSF2的表達變化。構(gòu)建HSF2過表達和shRNA干擾慢病毒,轉(zhuǎn)染HT29細胞株,通過熒光定量PCR和Western blot技術(shù)檢測慢病毒轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染HSF2干擾或者過表達慢病毒后,再用丁酸鈉處理細胞,電鏡觀察各組細胞中自噬泡和自噬小體的數(shù)量。GFP-LC3轉(zhuǎn)染實驗檢測自噬小體的數(shù)量。Western blot檢測自噬標志物LC3Ⅱ、beclin1和p62的表達變化。3,丁酸鈉誘導HT29細胞自噬,利用western blot方法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和insulin/IGF1信號通路中關(guān)鍵蛋白GRP78/BIP、PID、GRP94、mTOR及PI3K的表達水平,以及PI3K磷酸化水平。4,轉(zhuǎn)染HSF2慢病毒后,使用丁酸鈉處理HT29細胞。通過MTT檢測HT29細胞的增殖能力；通過Transwell細胞小室實驗評估細胞的侵襲能力；通過Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡；通過電鏡及western blot檢測過表達和干擾HSF2對上述過程中丁酸鈉所引起的自噬變化。[結(jié)果]1,50例潰瘍性結(jié)腸炎組織中HSF2的陽性表達率為62%(31/50),與30例正常對照組(30%,9/30)相比具有統(tǒng)計學差異。同時,透射電鏡觀察到潰瘍性結(jié)腸炎組織較對照組出現(xiàn)相對較多的自噬泡和自噬小體。熒光定量PCR和western blot檢測結(jié)果顯示與正常對照組相比,UC組患者的HSF2 mRNA轉(zhuǎn)錄和表達水平升高,自噬標志物LC3II和beclin-1的表達也較正常組增高,而底物p62的表達顯著降低。2,不同濃度的丁酸鈉處理HT29細胞后,HSF2的表達水平與丁酸鈉的濃度呈正相關(guān),同時LC3II的蛋白表達水平也不斷升高。5nM的丁酸鈉能誘導細胞發(fā)生自噬。轉(zhuǎn)染HSF2干擾慢病毒后,電鏡下的自噬小體數(shù)量明顯降低；免疫熒光顯微鏡顯示GFP-LC3標記的自噬小體數(shù)也明顯降低；同時丁酸鈉誘導的自噬標志物LC3II和beclinl和p62的表達變化受到相反的拮抗作用。3,丁酸鈉可以誘導并上調(diào)HT29細胞的GRP78/BIP表達,但對PID和GRP94的表達水平無影響；同時丁酸鈉也能夠上調(diào)IGF-1R和PI3K的表達,抑制mTOR的表達,誘導自噬；通過慢病毒轉(zhuǎn)染干擾HT29細胞的HSF2表達后,GRP78/BIP的表達水平降低,PID和GRP94表達水平無變化；干擾HSF2,能夠有效降低PI3K的表達水平,上調(diào)mTOR,降低自噬水平。然而,干擾HSF2表達并沒有改變IGF-1R的變化,說明HSF2可能直接通過 PI3K/mTOR信號通路作用,而非經(jīng)過IGF-1通路。4,2.5mmol/L以上濃度的丁酸鈉可以抑制HT-29細胞增值并誘導凋亡,并呈時間、濃度依賴性；進一步過表達HSF2后,HT-29細胞在丁酸鈉誘導凋亡環(huán)境下,過表達HSF2的細胞增值活性明顯升高,但沉默HSF2的HT-29細胞增值活性明顯下降；同時,過表達HSF2的HT-29細胞遷移率較未處理的細胞明顯增高,而沉默HSF2的HT-29細胞的這種趨勢減弱。過表達HSF2能拮抗丁酸鈉的這些作用,增強丁酸鈉誘導的HT-29細胞的自噬。過表達和沉默HSF2的HT-29凋亡和遷移實驗結(jié)果提示HSF2對腸上皮細胞可能起到保護和受損修復作用。[結(jié)論]1.潰瘍性結(jié)腸炎患者組織中HSF2高表達,同時,高表達HSF2的患者組織自噬水平較其他組別中顯著提高,提示HSF2在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病過程中可能起重要作用。2.丁酸鈉能夠誘導HT29細胞發(fā)生自噬,該自噬為HSF2依賴性。抑制HSF2的表達能夠降低丁酸鈉誘導的自噬水平。其機制可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和Insulin/IGF1信號通路相關(guān)。3.丁酸鈉能夠影響HT29細胞增殖、遷移和侵襲能力,并能促進細胞的凋亡。過表達HSF2能夠拮抗丁酸鈉的這些作用,同時能夠增強丁酸鈉誘導的自噬。這提示我們HSF2有可能成為潰瘍性結(jié)腸炎中的一個治療靶點。
【關(guān)鍵詞】：潰瘍性結(jié)腸炎 HSF2 自噬 丁酸鈉 分子機制
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R574.62
【目錄】：

• 中英文縮略詞6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-14
• 前言14-22
• 1. 潰瘍性結(jié)腸炎概述14
• 2. 熱休克轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄因子2(HSF2)與潰瘍性結(jié)腸炎關(guān)系14-15
• 3. 自噬概述及其與潰瘍性結(jié)腸炎關(guān)系15-17
• 4. 自噬的檢測方法17-20
• 5. 自噬與熱休克轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄因子220
• 6. 本研究的主要目的和意義20-22
• 第一部分、HSF2在UC的臨床樣本中同自噬的相關(guān)性22-41
• 1 材料22-24
• 2 方法24-33
• 3 結(jié)果33-39
• 4 討論39-41
• 第二部分、HSF2在體外細胞實驗中對丁酸鈉誘導的自噬的影響41-75
• 1 材料41-43
• 2 方法43-61
• 3 結(jié)果61-69
• 4 討論69-75
• 第三部分、HSF2促進丁酸鈉對HT-29細胞特性的影響75-88
• 1 材料75
• 2 方法75-79
• 3 結(jié)果79-85
• 4 討論85-88
• 全文總結(jié)88-90
• 參考文獻90-99
• 附錄99-101
• 附錄一：潰瘍性結(jié)腸炎診斷標準99-100
• 附錄二：UC病情活動程度100-101
• 綜述101-123
• 參考文獻114-123
• 攻讀學位期間獲得的學術(shù)成果123-124
• 致謝124

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