本文關(guān)鍵詞：熱休克轉(zhuǎn)錄因子2調(diào)控自噬在潰瘍性結(jié)腸炎中作用的研究

  更多相關(guān)文章： 潰瘍性結(jié)腸炎 HSF2 自噬 丁酸鈉 分子機(jī)制

【摘要】：[目的]潰瘍性結(jié)腸炎是炎癥性腸病的一個(gè)主要類型,屬于結(jié)、直腸粘膜的彌漫性炎癥。其臨床特點(diǎn)為原因不明的反復(fù)血便。目前尚無(wú)一個(gè)可明確的病因以及相應(yīng)有效的內(nèi)科治療方法。由于潰瘍性結(jié)腸炎在臨床診斷和治療方面較為復(fù)雜,還沒(méi)有很明確的直接有效的藥物,世界衛(wèi)生組織認(rèn)為潰瘍性結(jié)腸炎屬于難治愈的疾病之一。深入研究潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生的分子機(jī)制,尋找靶向治療或者有效的臨床緩解方案具有重要的臨床意義。已有的研究表明自噬在結(jié)、直腸炎癥中常常發(fā)生。而我們課題組前期的研究也發(fā)現(xiàn)HSF2在潰瘍性結(jié)腸炎患者中高表達(dá)。二者之間是否有聯(lián)系?是否能夠提供靶向治療的新思路?在本研究中,我們將對(duì)此做進(jìn)一步驗(yàn)證。研究將初步探索二者在潰瘍性結(jié)腸炎中的作用及可能的分子機(jī)制。[方法]1,收集診斷明確的潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜組織標(biāo)本50例,采用HE染色明確UC的特征性病理表現(xiàn),免疫組化方法檢測(cè)患者與30例正常對(duì)照組腸黏膜組織中HSF2的表達(dá)情況,分析與臨床病例特征的關(guān)系。透射電鏡觀察各組組織中自噬泡和自噬小體的數(shù)量。通過(guò)熒光定量和Western blot方法檢測(cè)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3Ⅱ的表達(dá)水平。2,利用不同濃度的丁酸鈉誘導(dǎo)HT29細(xì)胞自噬,觀察HSF2的表達(dá)變化。構(gòu)建HSF2過(guò)表達(dá)和shRNA干擾慢病毒,轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞株,通過(guò)熒光定量PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染HSF2干擾或者過(guò)表達(dá)慢病毒后,再用丁酸鈉處理細(xì)胞,電鏡觀察各組細(xì)胞中自噬泡和自噬小體的數(shù)量。GFP-LC3轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)自噬小體的數(shù)量。Western blot檢測(cè)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3Ⅱ、beclin1和p62的表達(dá)變化。3,丁酸鈉誘導(dǎo)HT29細(xì)胞自噬,利用western blot方法檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和insulin/IGF1信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白GRP78/BIP、PID、GRP94、mTOR及PI3K的表達(dá)水平,以及PI3K磷酸化水平。4,轉(zhuǎn)染HSF2慢病毒后,使用丁酸鈉處理HT29細(xì)胞。通過(guò)MTT檢測(cè)HT29細(xì)胞的增殖能力；通過(guò)Transwell細(xì)胞小室實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力；通過(guò)Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡；通過(guò)電鏡及western blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)和干擾HSF2對(duì)上述過(guò)程中丁酸鈉所引起的自噬變化。[結(jié)果]1,50例潰瘍性結(jié)腸炎組織中HSF2的陽(yáng)性表達(dá)率為62%(31/50),與30例正常對(duì)照組(30%,9/30)相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí),透射電鏡觀察到潰瘍性結(jié)腸炎組織較對(duì)照組出現(xiàn)相對(duì)較多的自噬泡和自噬小體。熒光定量PCR和western blot檢測(cè)結(jié)果顯示與正常對(duì)照組相比,UC組患者的HSF2 mRNA轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平升高,自噬標(biāo)志物L(fēng)C3II和beclin-1的表達(dá)也較正常組增高,而底物p62的表達(dá)顯著降低。2,不同濃度的丁酸鈉處理HT29細(xì)胞后,HSF2的表達(dá)水平與丁酸鈉的濃度呈正相關(guān),同時(shí)LC3II的蛋白表達(dá)水平也不斷升高。5nM的丁酸鈉能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬。轉(zhuǎn)染HSF2干擾慢病毒后,電鏡下的自噬小體數(shù)量明顯降低；免疫熒光顯微鏡顯示GFP-LC3標(biāo)記的自噬小體數(shù)也明顯降低；同時(shí)丁酸鈉誘導(dǎo)的自噬標(biāo)志物L(fēng)C3II和beclinl和p62的表達(dá)變化受到相反的拮抗作用。3,丁酸鈉可以誘導(dǎo)并上調(diào)HT29細(xì)胞的GRP78/BIP表達(dá),但對(duì)PID和GRP94的表達(dá)水平無(wú)影響；同時(shí)丁酸鈉也能夠上調(diào)IGF-1R和PI3K的表達(dá),抑制mTOR的表達(dá),誘導(dǎo)自噬；通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染干擾HT29細(xì)胞的HSF2表達(dá)后,GRP78/BIP的表達(dá)水平降低,PID和GRP94表達(dá)水平無(wú)變化；干擾HSF2,能夠有效降低PI3K的表達(dá)水平,上調(diào)mTOR,降低自噬水平。然而,干擾HSF2表達(dá)并沒(méi)有改變IGF-1R的變化,說(shuō)明HSF2可能直接通過(guò) PI3K/mTOR信號(hào)通路作用,而非經(jīng)過(guò)IGF-1通路。4,2.5mmol/L以上濃度的丁酸鈉可以抑制HT-29細(xì)胞增值并誘導(dǎo)凋亡,并呈時(shí)間、濃度依賴性；進(jìn)一步過(guò)表達(dá)HSF2后,HT-29細(xì)胞在丁酸鈉誘導(dǎo)凋亡環(huán)境下,過(guò)表達(dá)HSF2的細(xì)胞增值活性明顯升高,但沉默HSF2的HT-29細(xì)胞增值活性明顯下降；同時(shí),過(guò)表達(dá)HSF2的HT-29細(xì)胞遷移率較未處理的細(xì)胞明顯增高,而沉默HSF2的HT-29細(xì)胞的這種趨勢(shì)減弱。過(guò)表達(dá)HSF2能拮抗丁酸鈉的這些作用,增強(qiáng)丁酸鈉誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞的自噬。過(guò)表達(dá)和沉默HSF2的HT-29凋亡和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示HSF2對(duì)腸上皮細(xì)胞可能起到保護(hù)和受損修復(fù)作用。[結(jié)論]1.潰瘍性結(jié)腸炎患者組織中HSF2高表達(dá),同時(shí),高表達(dá)HSF2的患者組織自噬水平較其他組別中顯著提高,提示HSF2在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病過(guò)程中可能起重要作用。2.丁酸鈉能夠誘導(dǎo)HT29細(xì)胞發(fā)生自噬,該自噬為HSF2依賴性。抑制HSF2的表達(dá)能夠降低丁酸鈉誘導(dǎo)的自噬水平。其機(jī)制可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和Insulin/IGF1信號(hào)通路相關(guān)。3.丁酸鈉能夠影響HT29細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力,并能促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。過(guò)表達(dá)HSF2能夠拮抗丁酸鈉的這些作用,同時(shí)能夠增強(qiáng)丁酸鈉誘導(dǎo)的自噬。這提示我們HSF2有可能成為潰瘍性結(jié)腸炎中的一個(gè)治療靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：潰瘍性結(jié)腸炎 HSF2 自噬 丁酸鈉 分子機(jī)制
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R574.62
【目錄】：

• 中英文縮略詞6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-14
• 前言14-22
• 1. 潰瘍性結(jié)腸炎概述14
• 2. 熱休克轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄因子2(HSF2)與潰瘍性結(jié)腸炎關(guān)系14-15
• 3. 自噬概述及其與潰瘍性結(jié)腸炎關(guān)系15-17
• 4. 自噬的檢測(cè)方法17-20
• 5. 自噬與熱休克轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄因子220
• 6. 本研究的主要目的和意義20-22
• 第一部分、HSF2在UC的臨床樣本中同自噬的相關(guān)性22-41
• 1 材料22-24
• 2 方法24-33
• 3 結(jié)果33-39
• 4 討論39-41
• 第二部分、HSF2在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中對(duì)丁酸鈉誘導(dǎo)的自噬的影響41-75
• 1 材料41-43
• 2 方法43-61
• 3 結(jié)果61-69
• 4 討論69-75
• 第三部分、HSF2促進(jìn)丁酸鈉對(duì)HT-29細(xì)胞特性的影響75-88
• 1 材料75
• 2 方法75-79
• 3 結(jié)果79-85
• 4 討論85-88
• 全文總結(jié)88-90
• 參考文獻(xiàn)90-99
• 附錄99-101
• 附錄一：潰瘍性結(jié)腸炎診斷標(biāo)準(zhǔn)99-100
• 附錄二：UC病情活動(dòng)程度100-101
• 綜述101-123
• 參考文獻(xiàn)114-123
• 攻讀學(xué)位期間獲得的學(xué)術(shù)成果123-124
• 致謝124

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