本文關(guān)鍵詞：MiR34a調(diào)節(jié)HBV復(fù)制和對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及其機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： MiR-34a HBV復(fù)制 HNF4α 肝癌 增殖 SOX4

【摘要】：MicroRNAs (miRNAs)是一類非編碼小RNA,能在轉(zhuǎn)錄后水平上通過(guò)降解mRNA或抑制蛋白翻譯而調(diào)節(jié)許多靶基因的表達(dá)。這些miRNAs參與了包括細(xì)胞發(fā)育,凋亡,增殖和分化在內(nèi)的許多細(xì)胞學(xué)和生理學(xué)過(guò)程。肝細(xì)胞癌是第六大最常見(jiàn)惡性腫瘤,乙肝或丙肝病毒感染導(dǎo)致的慢性肝病是導(dǎo)致肝癌的主要誘發(fā)因素。但是目前對(duì)肝癌病人的治療策略很有限,迫切需要我們?nèi)シ治龈伟┌l(fā)病的致病機(jī)制,來(lái)尋找系統(tǒng)有效治療的新靶標(biāo)和發(fā)現(xiàn)新的早期診斷標(biāo)志物。許多研究發(fā)現(xiàn),miRNAs參與了乙肝病毒的復(fù)制與表達(dá),在病毒與宿主的相互作用中起著關(guān)鍵作用。異常表達(dá)的miRNAs也能通過(guò)靶向調(diào)節(jié)與癌癥相關(guān)信號(hào)通路的基因,而作為致癌或抑癌基因參與到肝癌的發(fā)病或發(fā)展中。異常表達(dá)的miRNAs在病毒與宿主互作和肝癌發(fā)展中的作用暗示,miRNAs可能成為治療的靶標(biāo)或治療工具。本文的第一部分,我們利用構(gòu)建的miRNA表達(dá)載體庫(kù)在細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染模型中進(jìn)行HBV復(fù)制相關(guān)miRNA分子的篩選,并選擇其中具有代表性的niRNA分子進(jìn)行抗HBV復(fù)制的分子機(jī)制研究。首先使用具有HBV低水平復(fù)制的肝癌細(xì)胞系HepG2.2.15作為篩選模型,從我們構(gòu)建的miRNA表達(dá)庫(kù)中篩選與HBV復(fù)制有潛在關(guān)聯(lián)的miRNA。對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清HBsAg蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)有5種miRNAs與HBV的HBsAg蛋白表達(dá)相關(guān)：miR-let-7g, miR-101, miR-345促進(jìn)了HBsAg的表達(dá),而miR-34a和miR-92b抑制了HBsAg的表達(dá)。我們繼續(xù)在瞬轉(zhuǎn)HBV表達(dá)載體的HepG2細(xì)胞中檢測(cè)這5中miRNAs對(duì)HBsAg/HbeAg的影響。結(jié)果顯示miR-34a仍能夠顯著抑制HBsAg/HBeAg的表達(dá),而其他miRNAs卻沒(méi)有明顯效果。通過(guò)定量PCR檢測(cè),miR-34a在大部分肝癌組織中為低表達(dá)水平。所以我們選擇miR-34a作為候選基因,研究其在HBV復(fù)制中作用及調(diào)節(jié)機(jī)制。我們?cè)贖epG2.2.15細(xì)胞中檢測(cè)了miR-34a對(duì)上清HBsAg/HBeAg、HBV DNA和HBV細(xì)胞內(nèi)HBV RNA、復(fù)制中間體、HBCAg蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)miR-34a顯著抑制HBV的復(fù)制與表達(dá)；而抑制miR-34a表達(dá)水平能明顯促進(jìn)HBV的復(fù)制與表達(dá)。我們進(jìn)一步研究niR-34a對(duì)HBV復(fù)制與表達(dá)的分子機(jī)制研究。通過(guò)HBV序列分析,末找到miR-34a的直接靶標(biāo)；排除了miR-34a直接作用于HBV轉(zhuǎn)錄子可能。我們推測(cè),miR-34a有可能通過(guò)調(diào)節(jié)與HBV復(fù)制相關(guān)的肝轉(zhuǎn)錄因子,使用分析軟件發(fā)現(xiàn),在對(duì)miR-34a預(yù)測(cè)的靶基因中包含一些重要的與HBV復(fù)制相關(guān)的肝轉(zhuǎn)錄因子,包括HNF1A、FOXA1、HNF4A, HNF4G等。我們使用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)驗(yàn)證niR-34a對(duì)靶基因的作用,結(jié)果顯示miR-34a表達(dá)能降低HNF4A和HNF4G的3'UTR熒光素酶活性。過(guò)表達(dá)miR-34a能抑制HNF4A mRNA和蛋白的表達(dá)。通過(guò)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),肝癌組織HNF4A表達(dá)與miR-34a表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。我們也研究了niR-34a對(duì)HBV啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的影響,我們把所有的HBV啟動(dòng)子克隆到報(bào)告基因載體上,并與miR-34a共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞,熒光素酶報(bào)告檢測(cè)表明,miR-34a的過(guò)表達(dá)抑制HBV啟動(dòng)子PreS1、PreS2/S和增強(qiáng)子II的活性,這與HNF 4A對(duì)HBV的作用一致。以上的結(jié)果證明：HNF4A是miR-34a抑制HBV復(fù)制與表達(dá)的調(diào)解者。本文的第二部分,為了研究miR-34a在肝癌中生物學(xué)功能,我們?cè)贖epG2和Bel7404細(xì)胞中分別對(duì)miR-34a進(jìn)行過(guò)表達(dá)和低表達(dá)的研究,采用MTT、細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)miR-34a對(duì)肝癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)移和增殖的影響。結(jié)果表明,miR-34a在肝癌細(xì)胞中表達(dá)水平與遷移侵襲能正相關(guān)；在肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-34a顯著抑制細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,而且miR-34a過(guò)表達(dá)還能抑制肝癌增殖能力,減緩了細(xì)胞周期G1-S的轉(zhuǎn)變。接下來(lái),我們對(duì)miR-34a肝癌細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行了初步研究,使用miRNA預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)致癌基因SOX4是miR-34a潛在的靶標(biāo),通過(guò)使用報(bào)告基因檢測(cè)到SOX4的3'UTR的熒光素酶活性受到miR-34a的顯著抑制,所以作為已經(jīng)在卵巢癌中被報(bào)道能促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的致癌基因SOX4是miR-34a的靶基因。SOX4的過(guò)表達(dá)能部分去除miR-34a對(duì)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖的抑制水平。另外,在,niR-34a低表達(dá)的細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)上調(diào),并且SOX4的高表達(dá)顯著增強(qiáng)了β-catenin的表達(dá),這些結(jié)果這說(shuō)明miR-34a的低表達(dá)可能通過(guò)上調(diào)SOX4及激活Wnt/p-catenin信號(hào)通路,最終促進(jìn)細(xì)胞的增殖。
【關(guān)鍵詞】：MiR-34a HBV復(fù)制 HNF4α 肝癌 增殖 SOX4
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7;R512.62
【目錄】：

• 致謝5-6
• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 引言12-15
• 第一部分 MIR-34A對(duì)HBV的復(fù)制和表達(dá)的影響研究15-61
• 1 前言15-17
• 2 材料和方法17-39
• 3 結(jié)果39-58
• 4 討論58-61
• 第二部分 MIR-34A對(duì)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和增殖的影響研究61-85
• 1 前言61-62
• 2 材料與方法62-71
• 3 結(jié)果71-82
• 4 討論82-85
• 結(jié)論85-87
• 參考文獻(xiàn)87-96
• 附錄96-100
• 綜述100-121
• 參考文獻(xiàn)112-121
• 作者簡(jiǎn)歷及博士在讀期間所取得的科研成果121

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