本文關(guān)鍵詞：胎盤來源間充質(zhì)干細胞在肝衰竭治療中的應(yīng)用及其代謝組學(xué)機制研究

  更多相關(guān)文章： 急性肝衰竭 細胞移植 中國小型豬 胎盤 間充質(zhì)干細胞 門靜脈 代謝組學(xué)

【摘要】：研究背景 急性肝功能哀竭(acute liver failure, ALF)是一類由各種原因引起的,以短期內(nèi)肝細胞大量壞死、進展迅速的肝性腦病和嚴(yán)重的肝功能損害為特征,并產(chǎn)生一系列并發(fā)癥的嚴(yán)重的肝功能障礙性疾病。發(fā)病率高,病死率更是高達70-80%,是目前醫(yī)學(xué)上最棘手的難題之一。近年,干細胞因其多向分化潛能,應(yīng)用于移植治療急性肝衰竭成為研究熱點。 干細胞在一定的內(nèi)環(huán)境下能夠定向分化為類肝細胞,分泌相關(guān)細胞因子,促進受損肝臟的修復(fù)和再生。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell, MSC)是干細胞家族的重要成員,因其來源廣泛、具有高度的自我復(fù)制能力和多向分化潛能,以及獨特的低免疫原性等而成為細胞移植合適的細胞源。骨髓來源的MSc是目前研究最為廣泛深入的種子細胞,但其受來源、MSc含量低等限制�，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)MSC還可來源于臍血、臍帶、脂肪和胎盤等多種組織。特別是胎盤來源的間充質(zhì)干細胞(human placental mesenchymal stem cells, hPMSCs),和骨髓MSC有著極其一致的生物學(xué)特性,且免疫源性更低,增殖分化能力更強。同時胎盤在臨床上為廢棄物,取材幾乎不受限制,且不涉及倫理問題；因此,它不但能夠成為骨髓MSC的理想替代物,而且有更廣闊的應(yīng)用潛能。本研究擬分離、培養(yǎng)胎盤來源的間充質(zhì)干細胞,并進行生物學(xué)特征鑒定。 ALF發(fā)病機制非常復(fù)雜,建立一個穩(wěn)定可靠的動物模型至關(guān)重要。目前國內(nèi)外研究肝損傷修復(fù)的模型大多采用小鼠、大鼠等嚙齒類動物,本研究擬采用中國小型豬,利用半乳糖胺(D-galactosamine, GalN)誘導(dǎo)法建立穩(wěn)定的ALF動物模型,通過hPMSCs細胞移植來研究治療的可行性和安全性,并進行療效判斷。為hPMSCs移植治療肝衰竭的臨床應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。 肝臟是人體重要的代謝器官,肝功能衰竭時血清中很多內(nèi)源性物質(zhì)的濃度會升高,如芳香族氨基酸、膽紅素、自由脂肪酸、血清氨、苯二氮卓類以及促炎癥細胞因子等。隨著病情的發(fā)展,體內(nèi)眾多內(nèi)源性代謝物的水平也在發(fā)生相應(yīng)的變化。代謝組學(xué)是近年發(fā)展起來的一種系統(tǒng)生物學(xué)方法,能準(zhǔn)確而全面的測定生物體體液中小分子代謝物的變化,反映外界刺激或遺傳修飾下生物體的代謝應(yīng)答變化,其研究對象主要是相對分子質(zhì)量在1000以下的內(nèi)源性小分子代謝物。本研究將采用代謝組學(xué)手段,揭示在ALF病情發(fā)展和hPMSCs移植治療ALF的全過程中內(nèi)源性代謝物的動態(tài)變化模式,分析細胞移植治療對ALF代謝譜的影響；從代謝組學(xué)角度揭示細胞移植治療急性肝衰竭的分子機制。 方法 采用膠原酶消化、密度梯度離心法進行胎盤來源的間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng),然后進行生物學(xué)特征鑒定,包括流式細胞術(shù)測定細胞表面標(biāo)志；成骨、成脂、成肝定向誘導(dǎo)分化；對體外誘導(dǎo)出的類肝細胞進行肝細胞功能測定。 采用頸靜脈注射半乳糖胺的方法建立中國小型豬ALF動物模型。造模后分為四組：A：無細胞移植組；B:hPMSCs通過頸靜脈途徑移植組；C：致死劑量X線照射的hPMSCs門靜脈途徑移植組；D:hPMSCs門靜脈途徑移植組。采集移植前后外周血,肝穿和尸檢取肝組織,通過分析造模前后和不同移植途徑中國小型豬存活率、血清生化指標(biāo)、肝組織免疫組化染色和分子生物學(xué)測定,評價hPMSCs移植治療的合適途徑及療效。 采用基于超高效液相色譜與串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)(ultra performance liquid chromatography combined with time-of-flight mass spectrometry,UPLC-Q/TOF-MS)的代謝組學(xué)方法,對造模前后和細胞移植前后采集的血清進行代謝組學(xué)分析。用MarkerLynx XS (ver.4.1)(Waters Co., Mil-ford, MA)和SIMCA-P+12.0(Umetrics AB, Sweden)等軟件進行多元統(tǒng)計分析。 結(jié)果 從胎盤中分離到的hPMSCs在體外可長期培養(yǎng),高表達HLA-Ⅰ, CD29, CD73,CD13和CD90,幾乎不表達HLA-Ⅱ, CD45%, CD34, CD133, CD31和CD79b,在體外能定向誘導(dǎo)分化為成骨細胞、脂肪細胞和有功能的類肝細胞。 多元統(tǒng)計分析結(jié)果顯示肝衰竭對照組與細胞移植組的代謝譜動態(tài)變化有顯著差別,模型豬的正常生理代謝被干擾,急性肝衰竭過程中出現(xiàn)明顯的代謝紊亂。甘氨熊脫氧膽酸(GUDCA)、甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)和芳香族氨基酸(AAA),在急性肝衰竭過程中含量明顯增加；與之相反是磷脂酰膽堿(PC)、溶血磷脂酰膽堿(LPC)和鞘磷脂(SM)在急性肝衰竭過程中明顯下降。細胞經(jīng)門靜脈途徑移植后,模型豬肝臟功能顯著改善,丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、膽堿酯酶(CHE)、總膽紅素(TBIL)和總膽汁酸(TBA)濃度逐漸恢復(fù)到正常范圍；細胞移植后,代謝紊亂得到緩解改善,代謝物最終接近正常對照組。從代謝軌跡分析得到的結(jié)果與從生化數(shù)據(jù)分析和組織學(xué)檢查所得到的結(jié)果相一致。同時,組化染色結(jié)果表明,肝臟炎癥反應(yīng)明顯改善,肝細胞變性和壞死得以緩解；而其他三組指標(biāo)改變不明顯。門靜脈移植組與其他三組比較,7天存活率明顯延長并有顯著性差異。免疫組化和反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)(RT-PCR)結(jié)果表明門靜脈移植途徑動物肝臟中有人細胞的定植。 結(jié)論 人胎盤來源的間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)外都可以定向分化為有功能的類肝細胞,細胞移植后可顯著延長模型豬的存活時間。門靜脈移植途徑優(yōu)于頸靜脈移植。B超定位下的門靜脈移植hPMSCs可作為治療肝臟疾病的新手段。代謝組學(xué)可用于揭示hPMSCs移植后ALF恢復(fù)分子機制,為肝臟疾病的干細胞療法提供了實驗基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：急性肝衰竭 細胞移植 中國小型豬 胎盤 間充質(zhì)干細胞 門靜脈 代謝組學(xué)
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R575.3
【目錄】：

• 致謝6-8
• 中文摘要8-12
• Abstract12-17
• 主要縮略語表17-25
• 第一部分：人胎盤來源的間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)和鑒定25-47
• 1. 前言25-27
• 2. 材料和方法27-34
• 3. 結(jié)果34-45
• 4. 討論45-46
• 5. 結(jié)論46-47
• 第二部分：HPMSCS移植治療急性肝衰竭的實驗研究47-70
• 1. 前言47-49
• 2. 材料和方法49-54
• 3. 結(jié)果54-66
• 4. 討論66-69
• 5. 結(jié)論69-70
• 第三部分：HPMSCS移植治療ALF的代謝組學(xué)研究70-94
• 1. 前言70-71
• 2. 材料和方法71-75
• 3. 結(jié)果75-90
• 4. 討論90-93
• 5. 結(jié)論93-94
• 全文結(jié)論94-96
• 創(chuàng)新點96-97
• 參考文獻97-115
• 附錄115-120
• 文獻綜述120-130
• 參考文獻126-130
• 作者簡歷及在學(xué)習(xí)工作經(jīng)歷與主要科研成果130-136
• 附件136-144

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李艷菊;劉洋;王茜;;間充質(zhì)干細胞治療[J];中國輸血雜志;2008年10期

2 王軍;肖田安;鄧國東;吳荔琴;方炳虎;;豬肌肉與肝臟中卡拉洛爾高效液相色譜檢測方法的研究[J];動物醫(yī)學(xué)進展;2011年04期

3 劉建功;郭萬龍;張淑賢;段志凱;;間充質(zhì)干細胞在急性輻射損傷治療中的作用綜述[J];輻射研究與輻射工藝學(xué)報;2010年03期

4 湯文彬;李孝建;;混合皮膚移植誘導(dǎo)的免疫耐受[J];廣東醫(yī)學(xué);2010年05期

5 馮德鵬;李雪莉;范炎;;臍血間充質(zhì)干細胞的研究進展[J];國際老年醫(yī)學(xué)雜志;2010年05期

6 張璐珊;劉云飛;張新忠;鄭姍姍;;苯并咪唑類獸藥殘留分析研究進展[J];中國畜牧獸醫(yī);2009年03期

7 韓榮偉;王加啟;鄭楠;許曉敏;甄云鵬;屈雪寅;趙連生;;牛奶質(zhì)量安全主要風(fēng)險因子分析 Ⅲ.獸藥殘留[J];中國畜牧獸醫(yī);2012年04期

8 嚴(yán)麗娟;張潔;潘晨松;林立毅;張欣怡;申河清;;超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜法高通量篩查乳制品中20種鎮(zhèn)靜劑[J];分析化學(xué);2013年01期

9 王振常;黃晶晶;呂建林;潘哲;;干細胞移植治療慢性肝衰竭18例的療效評價[J];廣西醫(yī)學(xué);2013年07期

10 劉磊;劉作金;;骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)免疫耐受的研究進展[J];國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志;2013年18期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 陳常輝;余方圓;;干細胞關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射修復(fù)軟骨損傷的研究與進展[A];中國醫(yī)藥教育論壇-中國醫(yī)藥教育協(xié)會第三屆三次理事大會暨學(xué)術(shù)年會論文專輯[C];2013年

2 束禮梅;呂宏英;;rhG—CSF在腫瘤化療中的應(yīng)用[A];國家級胸部腫瘤治療護理新進展學(xué)習(xí)班暨2013浙江省抗癌協(xié)會腫瘤護理年會論文集[C];2013年

3 巫貴成;王輝;鐘慶;何澤清;鄧元明;;自體骨髓干細胞移植治療肝衰竭的初步觀察[A];第二屆全國病毒性肝炎慢性化重癥化基礎(chǔ)與臨床研究進展學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2012年

4 侯玉潔;陳長功;王桂明;谷雪;王彥;閆超;;基于UPLC-QTOF-MS的乙型肝炎代謝組學(xué)研究[A];第十屆全國生物醫(yī)藥色譜及相關(guān)技術(shù)學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2014年

5 郭明星;彭瓏;張立;劉海玉;高曉燕;;清開靈注射液藥物代謝物組學(xué)研究[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會中藥化學(xué)分會第八屆學(xué)術(shù)年會論文集[C];2013年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 孫曉春;不同來源間質(zhì)干細胞的分離及多種藥物因素對其生物學(xué)特性的影響[D];江蘇大學(xué);2010年

2 史丹;成人脂肪來源Flk-1+間充質(zhì)干細胞免疫調(diào)節(jié)功能相關(guān)研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2008年

3 龔勇泉;骨髓間充質(zhì)干細胞對小鼠肺移植急性排斥反應(yīng)的保護作用[D];華中科技大學(xué);2011年

4 楊大志;BMP-2/膠原/摻鍶羥基磷灰石成骨活性材料的研究[D];華中科技大學(xué);2011年

5 包新杰;移植人骨髓間充質(zhì)干細胞促進大鼠腦梗死后神經(jīng)再生及功能恢復(fù)[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

6 司中洲;供體骨髓間充質(zhì)干細胞輸注對大鼠移植肝的免疫保護作用的研究[D];中南大學(xué);2011年

7 李姍霓;受體骨髓間充質(zhì)干細胞抑制大鼠異位小腸移植急性排斥反應(yīng)機制的實驗研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2011年

8 唐亮;正常和增生牙齦來源間充質(zhì)干細胞的鑒定及其功能研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2011年

9 馮曜宇;臍帶間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)染HGF基因?qū)Ω螕p傷再生的研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2008年

10 索利敏;臍血間充質(zhì)干細胞體外分化為鼻黏膜纖毛上皮細胞的研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2009年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張陽;體外培養(yǎng)人的骨髓間充質(zhì)干細胞的生物安全性分析[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2011年

2 高楊;人臍血間充質(zhì)干細胞對肝癌轉(zhuǎn)移的影響及機制的探討[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2011年

3 趙鵬;不同濃度人臍帶間充質(zhì)干細胞移植修復(fù)脊髓損傷的實驗研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2011年

4 劉瑩;肝衰竭患者血清胸腺素β4的檢測及臨床意義[D];天津醫(yī)科大學(xué);2011年

5 楊玲玲;大鼠同種異體骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療急性肝衰竭的實驗研究[D];南昌大學(xué);2011年

6 徐璐;骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)腎移植免疫耐受的臨床初步研究[D];廣州醫(yī)學(xué)院;2010年

7 馮德朋;臍血間充質(zhì)干細胞移植治療帕金森大鼠的實驗研究[D];泰山醫(yī)學(xué)院;2011年

8 鐘衛(wèi)衛(wèi);急性肝衰竭小鼠肝組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)及Cyclin D1、HGF受體c-met表達和意義[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2011年

9 齊丙迪;第三方骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)同種異體移植受體免疫耐受機制的研究[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2011年

10 施鵬旭;肝臟部分切除對肝臟干細胞增殖的影響[D];大連醫(yī)科大學(xué);2011年

，

本文編號：712085