發(fā)布時間：2017-08-20 23:16

  本文關(guān)鍵詞：真皮來源間充質(zhì)細(xì)胞移植促進(jìn)小鼠肝損傷修復(fù)的實驗研究

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【摘要】：研究背景肝臟是具有高度再生能力且能對外界損傷發(fā)揮生物學(xué)防御功能的重要器官。然而當(dāng)外界損傷程度加劇繼而導(dǎo)致肝臟發(fā)生功能障礙時,肝臟固有再生潛能將會被抑制,從而導(dǎo)致包括肝功能衰竭在內(nèi)的嚴(yán)重后果。目前,終末期肝病患者的死亡率高。對于多數(shù)嚴(yán)重的肝臟疾病來說,仍然沒有十分有效的治療手段。雖然肝移植是終末期肝病患者的主要治療手段,其4年存活率≥70%,但由于其供體器官來源相對緊缺、移植費用相對昂貴以及存在較高移植物排斥反應(yīng)等因素而限制了其進(jìn)一步在肝臟疾病治療領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。間充質(zhì)干細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞(MSCs)具有分化及轉(zhuǎn)分化為多種類型細(xì)胞、刺激機(jī)體再生和修復(fù)損傷組織/器官的能力,以MSCs為主的細(xì)胞治療近年來已在不同臟器的再生醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域廣泛地開展研究。研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞移植能有效的緩解實驗性肝衰竭并促進(jìn)肝臟再生。這被認(rèn)為是可替代肝移植治療肝臟疾病的潛在有效方法。已有I期臨床試驗表明移植骨髓來源的MSCs可以改善肝硬化患者的肝功能。相比于MSCs,不同組織特異性的間充質(zhì)細(xì)胞同樣具有再生和免疫調(diào)節(jié)功能,可被應(yīng)用于細(xì)胞治療領(lǐng)域。由表皮、真皮及其附屬器組成的皮膚被認(rèn)為是包括人類在內(nèi)的哺乳動物的最大器官。既往研究表明皮膚真皮層內(nèi)存在著豐富的MSC樣細(xì)胞群。由于真皮分布廣泛且容易獲得,這些真皮來源的細(xì)胞被認(rèn)為是各種疾病進(jìn)行自體細(xì)胞治療的潛在來源。我們前期的研究已經(jīng)表明移植皮膚來源的間充質(zhì)細(xì)胞(DMCs)可促進(jìn)復(fù)合放射性損傷大鼠的存活和創(chuàng)面愈合。我們最近的研究表明DMCs移植可降低急性GVHD的發(fā)病率和病情嚴(yán)重程度,也可促進(jìn)膿毒癥小鼠的存活。許多研究表明來源于皮膚真皮層的成纖維細(xì)胞可以被誘導(dǎo)分化為具有肝細(xì)胞特性和功能的細(xì)胞。然而,有關(guān)DMCs能否直接促進(jìn)肝損傷修復(fù)及DMCs對于不同類型肝損傷是否有治療潛能的問題都需進(jìn)一步研究探討。因而,本課題主要采用兩個肝損傷動物模型,對DMCs移植肝損傷的治療作用進(jìn)行研究。研究方法1.DMCs移植對CCL4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化修復(fù)作用的研究1.1dmcs移植對ccl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化水平的影響通過天狼星紅染色、collageni抗體免疫組化染色和肝組織羥脯氨酸含量測定等方法評價了dmcs移植對ccl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化水平的影響;1.2dmcs移植對ccl4誘導(dǎo)肝纖維化小鼠肝功能的影響通過受試小鼠血清肝功能檢測、小鼠肝組織切片的ki67、pck抗體免疫組化染色及肝組織切片tunel染色來評價了dmcs移植對ccl4誘導(dǎo)肝纖維化小鼠肝功能和肝組織再生的影響;1.3dmcs移植改善小鼠肝纖維化的機(jī)制研究通過westernblot和免疫組化實驗研究了dmcs移植對纖維化肝組織中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平和肝纖維化關(guān)鍵分子tgf-β表達(dá)的影響。體外dmcs與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)試驗中研究了dmcs對炎癥關(guān)鍵細(xì)胞巨噬細(xì)胞功能的影響。2.dmcs移植對放射損傷小鼠肝內(nèi)的定植情況及其對急性肝損傷修復(fù)的研究2.1dmcs移植對放射損傷小鼠的存活影響及dmcs在小鼠各臟器的定植情況觀察了dmcs移植對8gy致死劑量放射損傷小鼠的存活有無促進(jìn)作用,并通過gfp抗體免疫組化染色試驗研究了dmcs在急性放射損傷小鼠各個臟器的定植情況;2.2dmcs移植放射損傷對小鼠肝功能的影響通過受試小鼠血清肝功能檢測、血清crp的elisa檢測和小鼠肝組織切片he染色來評價了dmcs移植對急性放射損傷小鼠肝臟功能的影響;2.3定植于放射小鼠肝內(nèi)真皮來源的細(xì)胞的特征研究通過免疫熒光雙標(biāo)染色研究了定植于放射損傷小鼠肝臟內(nèi)dmcs的表型,并進(jìn)一步探索了其生物學(xué)特性;通過基因芯片分析了diecs、dmcs和bmmφ三者之間差異基因的表達(dá)情況。研究結(jié)果1.dmcs移植對ccl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化修復(fù)作用的研究1.1小鼠肝組織切片的天狼星紅染色、collageni抗體免疫組化染色以及肝組織羥脯氨酸含量測定試驗表明dmcs門靜脈移植能夠顯著改善ccl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化水平;gfp抗體免疫組化染色結(jié)果表明dmcs在肝纖維化小鼠的肝內(nèi)發(fā)生短暫定植而不是長期定植;1.2受試小鼠血清肝功能檢測、小鼠肝組織切片的ki67、pck抗體免疫組化染色及肝組織切片tunel染色試驗表明dmcs移植能夠改善小鼠肝功能和促進(jìn)小鼠肝組織再生、減緩肝內(nèi)細(xì)胞發(fā)生凋亡;1.3westernblot和tgf-β抗體免疫組化染色結(jié)果表明dmcs移植可以通過促進(jìn)肝纖維化小鼠肝組織高表達(dá)自噬相關(guān)蛋白lc3b和低表達(dá)p62并抑制了肝內(nèi)誘導(dǎo)纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵分子tgf-β的表達(dá),進(jìn)而來改善受試小鼠肝纖維化水平;1.4dmcs與巨噬細(xì)胞體外共培養(yǎng)實驗表明dmcs能夠抑制經(jīng)lps刺激巨噬細(xì)胞raw264.7分泌促炎因子il-1β、il-6和促進(jìn)其分泌抗炎因子il-10,抑制經(jīng)lps刺激raw264.7和腹腔巨噬細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)raw264.7和腹腔巨噬細(xì)胞的體外遷移,促進(jìn)raw264.7和腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力。同時dmcs腹腔移植clp小鼠試驗也表明dmcs可促進(jìn)clp小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力。2.dmcs移植對放射損傷小鼠肝內(nèi)的定植情況及其對急性肝損傷修復(fù)的研究2.1dmcs移植能夠促進(jìn)8gy致死劑量放射小鼠的存活;gfp抗體免疫組化染色試驗表明移植的dmcs能夠選擇性地長期定植于放射損傷小鼠的肝內(nèi),受試小鼠血清肝功能檢測、血清crp的elisa檢測和小鼠肝組織切片he染色試驗表明dmcs移植具有一定的抗炎保護(hù)效應(yīng),能夠改善放射損傷小鼠肝功能,減緩放射損傷引起的肝細(xì)胞脂肪變性,即dmcs移植促進(jìn)了放射損傷小鼠肝組織的損傷修復(fù);2.2通過免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果表明長期定植于放射損傷小鼠肝的dmcs呈vimentin+、cd45+和f4/80+,在體熒光微球吞噬試驗表明定植于放射損傷小鼠肝的dmcs具有吞噬功能,進(jìn)而提示該群細(xì)胞具有巨噬細(xì)胞樣表型;2.3ki67gfp免疫雙標(biāo)染色試驗表明定植于放射損傷小鼠肝的dmcs的這群細(xì)胞具有增殖特性,對其進(jìn)行體外培養(yǎng)也表明該群細(xì)胞增殖旺盛,進(jìn)而表明定植于放射損傷小鼠肝內(nèi)的dmcs在體內(nèi)及體外條件下均展現(xiàn)出穩(wěn)定增殖潛能;2.4定植于放射損傷小鼠肝內(nèi)的那群真皮間充質(zhì)來源的巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞與bmmφ及raw264.7有著不同的性狀:具有巨噬細(xì)胞特性并能夠參與全身放射所引起的肝損傷修復(fù);獲得diecs、dmcs和bmmφ三種細(xì)胞差異基因表達(dá)譜結(jié)論本課題采用小鼠慢性肝損傷和小鼠急性肝損傷這兩種動物模型以研究dmcs移植對肝損傷的潛在治療作用。首先,我們采用ccl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型來研究dmcs移植對小鼠慢性肝損傷修復(fù)的作用。而后,我們采用8gy致死劑量照射小鼠所致急性放射性肝損傷模型研究dmcs移植對小鼠急性肝損傷修復(fù)的作用。本課題的主要結(jié)果包括:1.dmcs移植治療ccl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型中dmcs通過旁分泌及營養(yǎng)支持、抑制tgf-β信號通路、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等機(jī)制同時影響肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的多個環(huán)節(jié)因素,顯著改善了小鼠肝纖維化和促進(jìn)小鼠肝組織再生;2.DMCs移植治療致死劑量照射小鼠所致急性肝損傷模型中,DMCs移植能夠促進(jìn)致死劑量照射小鼠的存活,且能夠選擇性長期定植于小鼠肝內(nèi)并促進(jìn)該急性放射性肝損傷的修復(fù),并獲得了DIECs、DMCs和BMMφ三種細(xì)胞的差異基因表達(dá)譜,為后續(xù)進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ);3.DMCs移植治療兩種不同類型肝損傷,由于兩種肝損傷的受損組織區(qū)域微環(huán)境的不同,DMCs發(fā)揮治療效應(yīng)的機(jī)制有所不同,因此在進(jìn)行細(xì)胞治療研究時需要考慮到因組織損傷不同而導(dǎo)致的微環(huán)境的差異這一因素,以便選擇更為合適的細(xì)胞來治療類型更為合適的組織損傷。
【關(guān)鍵詞】：真皮來源間充質(zhì)細(xì)胞 肝損傷 細(xì)胞治療 肝纖維化 輻射
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R575
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 英文摘要5-9
• 中文摘要9-13
• 第一章 前言13-17
• 第二章 真皮來源間充質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)小鼠肝纖維化修復(fù)的研究17-44
• 2.1 材料與方法17-26
• 2.2 結(jié)果26-40
• 2.3 討論40-42
• 2.4 小結(jié)42-44
• 第三章 真皮來源間充質(zhì)細(xì)胞在放射損傷小鼠肝內(nèi)的長期定植及其對急性肝損傷修復(fù)的作用44-82
• 3.1 材料與方法44-56
• 3.2 結(jié)果56-78
• 3.3 討論78-80
• 3.4 小結(jié)80-82
• 全文結(jié)論82-83
• 參考文獻(xiàn)83-92
• 文獻(xiàn)綜述一 肝損傷細(xì)胞治療的研究進(jìn)展92-109
• 參考文獻(xiàn)99-109
• 文獻(xiàn)綜述二 CCL4誘導(dǎo)小鼠肝損傷中細(xì)胞治療對其肝功能AST、ALT影響的系統(tǒng)回顧和meta分析109-129
• 參考文獻(xiàn)125-129
• 研究生期間發(fā)表的與課題相關(guān)的論文及獲獎情況129-130
• 致謝130

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1 曾樂;肝損傷的保守治療[J];中國急救醫(yī)學(xué);2002年05期

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本文編號：709456