本文關(guān)鍵詞：沉默Beclin1基因?qū)τ晖芩卣T導(dǎo)急性胰腺炎細胞模型的炎癥反應(yīng)及自噬的影響

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【摘要】：目的:自噬是生物體進化過程中存在的高度保守的細胞內(nèi)物質(zhì)降解過程,細胞通過形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體吞噬胞內(nèi)物質(zhì)后轉(zhuǎn)運至溶酶體中進行降解再利用。自噬在急性胰腺炎發(fā)生發(fā)展中作用的研究是當(dāng)前急性胰腺炎基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的主要熱點之一。自噬相關(guān)基因Beclin1是自噬起始階段的重要調(diào)控分子,本研究首先采用RNA干擾技術(shù)沉默大鼠胰腺腺泡細胞AR42J的Beclin1基因表達,構(gòu)建穩(wěn)定的Beclin1基因沉默的AR42J細胞系。通過原始細胞系與轉(zhuǎn)染后細胞株的對比,我們了解Beclin1基因在AR42J細胞的增殖、凋亡、自噬及糜蛋白酶表達中的作用,并進一步探討B(tài)eclin1基因?qū)τ晖芩卣T導(dǎo)的的急性胰腺炎細胞模型中炎性因子水平、凋亡、自噬及超微結(jié)構(gòu)的影響。方法:1.設(shè)計并合成3種靶向大鼠Beclin1 mRNA的shRNA及陰性對照shRNA,分別插入質(zhì)粒GV112,重組質(zhì)粒分別命名為p-sh-Beclin1-1、p-sh-Beclin1-2、p-sh-Beclin1-3及p-shRNA-NC。應(yīng)用lipo3000將重組質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)入AR42J細胞,應(yīng)用RT-PCR檢測細胞Beclin1 mRNA表達,篩選出沉默效率最高的質(zhì)粒,在293T細胞內(nèi)包裝成慢病毒(LV-shBeclin1),感染AR42J細胞,應(yīng)用嘌呤霉素篩選,采用RT-PCR及蛋白質(zhì)印跡法分別檢測病毒感染細胞Beclin1 mRNA和蛋白表達。2.采用CCK8試劑盒測定原始細胞系與轉(zhuǎn)染后細胞株的生長曲線,了解Beclin1基因?qū)R42J細胞增殖的作用。采用流式細胞技術(shù)檢測原始細胞系與轉(zhuǎn)染后細胞株的凋亡情況,了解Beclin1基因?qū)R42J細胞凋亡的影響。采用透射電鏡觀察兩組細胞的超微結(jié)構(gòu),了解Beclin1基因?qū)R42J細胞中自噬影響。采用免疫熒光技術(shù)觀察兩組細胞糜蛋白酶的表達情況,了解Beclin1基因?qū)R42J細胞中糜蛋白酶表達的影響。3.采用酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測雨蛙素誘導(dǎo)的的急性胰腺炎細胞模型不同時間點(0h、1h、4h、6h、8h、12h、24h、36h及48h)上清液中的炎性因子水平,及沉默Beclin1基因后炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)水平的改變,從而探討沉默Beclin1基因?qū)τ晖芩卣T導(dǎo)的的急性胰腺炎細胞模型中炎性因子水平的影響。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎細胞模型中不同時間點(0h、1h、4h、6h、8h、12h、24h及36h)的凋亡相關(guān)蛋白BCL2及自噬相關(guān)蛋白LC3表達水平,及沉默Beclin1基因后BCL2及LC3蛋白水平的改變,從而探討沉默Beclin1基因?qū)τ晖芩卣T導(dǎo)的的急性胰腺炎細胞模型中凋亡及自噬的影響。采用透射電鏡技術(shù)觀察以1×10~(-8)mol/L濃度的雨蛙素作用4h后的兩組細胞中自噬水平及炎癥程度,從而探討沉默Beclin1基因?qū)τ晖芩卣T導(dǎo)的的急性胰腺炎細胞模型超微結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果:1.重組質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離及測序證實shRNA序列符合預(yù)期。p-sh-Beclin1-1、p-sh-Beclin1-2、p-sh-Beclin1-3及p-shRNA-NC轉(zhuǎn)染后AR42J細胞Beclin1 mRNA表達抑制率分別為(17.8±4.0)%、(30.6±2.8)%、(45.8±7.7)%、(7.0±11.8)%。3個p-sh-Beclin1轉(zhuǎn)染細胞的表達抑制率均較未轉(zhuǎn)染細胞的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均0.05),而轉(zhuǎn)染p-shRNA-NC細胞的表達抑制率與未轉(zhuǎn)染細胞的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。抑制率最高的p-sh-Beclin1-3經(jīng)慢病毒包裝,感染AR42J細胞,應(yīng)用嘌呤霉素篩選,LV-shBeclin1感染細胞的Beclin1 mRNA表達抑制率為(86.1±1.2)%,蛋白表達抑制率為(87.9±2.8)%,均與未感染細胞無表達抑制的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均0.01)。2.沉默Beclin1基因?qū)R42J細胞增殖的影響并無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),但可以促進細胞的凋亡。沉默Beclin1基因使得AR42J細胞中自噬泡數(shù)目減少,但并不影響細胞糜蛋白酶的表達。3.酶聯(lián)免疫吸附實驗提示急性胰腺炎初期炎性因子水平逐步上升,6~8h時達最高峰后炎性因子水平逐漸下降后再次升高,36~48h時達到第二次高峰。沉默Beclin1基因后,相應(yīng)時間點的IL-1β水平下降、IL-6水平多數(shù)無明顯改變、TNF-α水平多數(shù)呈上升趨勢。蛋白質(zhì)印跡法提示沉默Beclin1基因使得雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎中不同時間點的BCL2多數(shù)下降,而LC3蛋白多數(shù)升高。以1×10~(-8)mol/L濃度的雨蛙素作用4h后,AR42J細胞中出現(xiàn)急性胰腺炎現(xiàn)象,而轉(zhuǎn)染后細胞株中自噬泡明顯減少,且并未觀察到炎癥改變。結(jié)論:成功建立Beclin1基因沉默的AR42J細胞株。Beclin1基因參與自噬體的形成,且可以抑制AR42J細胞的凋亡,它對細胞增殖和糜蛋白酶表達并無明顯影響。雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎細胞模型中炎性因子水平隨時間變化,呈先升后降再升的模式改變。沉默Beclin1基因影響急性胰腺炎中炎性因子水平,及凋亡自噬的程度,且它對雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎細胞模型有明顯的保護作用。同時本實驗建立的新型細胞株為探討B(tài)eclin1基因在急性胰腺炎發(fā)病機制中的作用提供新的細胞模型。
【關(guān)鍵詞】：Beclin1 iRNA 自噬 急性胰腺炎 AR42J
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R576
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 中英文縮略語表10-11
• 前言11-13
• 第一部分 穩(wěn)定沉默Beclin1基因的胰腺腺泡細胞株AR42J的建立13-21
• 一、材料與方法13-17
• 二、實驗結(jié)果17-19
• 三、討論19-21
• 第二部分 穩(wěn)定沉默Beclin1基因?qū)σ认傧倥菁毎脑鲋�、凋亡、自噬及糜蛋白酶表達的影響21-28
• 一、材料與方法21-23
• 二、實驗結(jié)果23-26
• 三、討論26-28
• 第三部分 穩(wěn)定沉默Beclin1基因?qū)τ晖芩卣T導(dǎo)的急性胰腺炎細胞模型中炎性因子水平、凋亡、自噬及超微結(jié)構(gòu)的影響28-37
• 一、材料與方法28-30
• 二、實驗結(jié)果30-35
• 三、討論35-37
• 全文總結(jié)37-38
• 全文參考文獻38-40
• 綜述40-46
• 參考文獻43-46
• 在讀期間發(fā)表論文、著作及獲獎情況46
• 參與科研項目46-47
• 致謝47

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

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3 李潔;劉曉;吳敏;郭曉榕;湛先保;;雨蛙肽誘導(dǎo)的實驗性急性胰腺炎細胞模型中酶噬的變化[J];中華消化雜志;2014年11期

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6 夏敏;沈美琴;陳衛(wèi)昌;;血清促炎細胞因子水平與急性胰腺炎嚴(yán)重程度的相關(guān)性研究[J];中華消化雜志;2011年06期

7 張磊;劉慶友;胡天;張曉溪;崔奎青;陸鳳花;石德順;;第三代慢病毒高效率包裝系統(tǒng)的建立[J];基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué);2009年02期

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本文編號：698383