本文關(guān)鍵詞：乙型肝炎病毒e抗原在HBV感染過程中作用機制的研究

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【摘要】：目的:探討不同免疫狀態(tài)下,乙型肝炎病毒本身蛋白HBeAg對人外周血單個核細胞(PBMC)表面共刺激分子CD83、PD-L1、Toll樣受體9、CD8細胞活化相關(guān)分子及細胞因子IFN-γ、IL-10的影響,進一步闡明HBe Ag對免疫細胞功能影響及其在乙型肝炎病毒感染慢性化過程中的機制。方法:從南昌大學第一附屬醫(yī)院感染科門診及住院部收集感染HBV后免疫耐受期、免疫清除期患者各20例,另從健康體檢者中嚴格篩選出20名健康者作為對照,收集其外周血分離PBMC,完全培養(yǎng)基溫育作為未刺激對照組,重組HBe Ag溫育作為HBe Ag刺激組,CPG-ODN1826溫育作為CPG-ODN1826刺激組,重組HBeAg刺激組聯(lián)合CPG-ODN1826溫育作為聯(lián)合刺激組。采用流式細胞技術(shù)檢測各組CD14+細胞表面CD83、PD-L1及CD8+細胞表面CD107a、CD107b的表達,逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法檢測TLR9-mRNA的表達,酶聯(lián)免疫吸附實驗(Elisa)檢測Th1型細胞因子IFN-γ及Th2型細胞因子IL-10的表達。結(jié)果:1、用不同濃度(1ug/ml、4ug/ml、10ug/ml、20ug/ml)HBe Ag與健康人PBMC共培養(yǎng)0、2、6、12、24、48 h后發(fā)現(xiàn),TLR9 mRNA及CD14+細胞表面CD83表達水平下降,而PD-L1的表達水平則升高,尤以10μg/mL濃度的HBe Ag刺激12 h時作用最明顯;隨著培養(yǎng)時間的延長上述各種表面標記逐漸恢復,至24h時已基本恢復到刺激前的水平。2、RT-PCR結(jié)果:健康對照者、免疫耐受患者、免疫清除患者PBMC經(jīng)10μg/ml的重組HBe Ag刺激12h后,TLR9-mRNA表達水平(0.362±0.021、0.342±0.019、0.394±0.031)均低于未刺激組(t值分別為-7.62、8.85、11.63,P均0.05),明顯低于CPG-ODN1826刺激組(t值分別為-23.54、-37.45、-30.91,P均0.05),差異有統(tǒng)計學意義;有低于重組HBeAg聯(lián)合CPG-ODN1826刺激組的趨勢(t值分別為-1.22、-1.78、-1.59,P均0.05),但差異無統(tǒng)計學意義。3、流式細胞儀檢測CD14+細胞表面CD83及PD-L1表達結(jié)果:(1)三組研究對象PBMC經(jīng)重組HBe Ag刺激后,CD83表達水平[(18.69±5.43)%、(15.09±2.62)%、(21.26±4.34)%]低于未刺激組(t=3.84,6.35,4.55,p均0.05),明顯低于cpg-odn1826刺激組(t=-6.42、-9.57、-7.18,p均0.05),差異有統(tǒng)計學意義;有低于聯(lián)合刺激組的趨勢(t=-1.22、-1.78、-1.59,p均0.05),但差異無統(tǒng)計學意義。(2)pd-l1表達水平[(79.01±6.08)%、(80.57±4.21)%、(70.64±4.56)%]明顯高于未刺激組(t=-5.78、-2.19、-5.16,p均0.05);高于cpg-odn1826刺激組(t=7.93、11.72、6.87,p均0.05)],差異有統(tǒng)計學意義;有高于聯(lián)合刺激組的趨勢(t=1.79、1.89、2.01,p均0.05)但差異無統(tǒng)計學意義。4、流式細胞儀檢測cd8+細胞表面cd107a、cd107b表達:(1)三組研究對象pbmc經(jīng)重組hbeag刺激后,cd107a表達水平[(5.73±2.15)%、(4.15±0.79)%、(7.54±2.18)%]低于未刺激組(t=2.90、5.51、2.73,p均0.05)],明顯低于cpg-odn1826刺激組[t=-5.88、-5.06、-7.25,p均0.05],差異有統(tǒng)計學意義;有低于聯(lián)合刺激組的趨勢(t=-0.78、-1.72、-1.83,p均0.05),但差異無統(tǒng)計學意義。(2)cd107b表達水平[(1.59±1.06)%、(0.84±0.43)%、(2.15±0.45)%]低于cpg-odn1826刺激組(t=-4.38、-3.37、-4.87,p均0.05),差異無統(tǒng)計學意義;有低于未刺激組的趨勢(t=1.21、2.08、1.79,p均0.05),有高于聯(lián)合刺激組的趨勢(t=-1.88、-1.53、-1.99,p均0.05),差異無統(tǒng)計學意義;(3)三組患者經(jīng)不同刺激物溫育后,cd107表達水平趨勢與cd107a一致,但cd8+t細胞比例無明顯改變,差異無統(tǒng)計學意義。5、elisa結(jié)果:(1)三組研究對象pbmc經(jīng)重組hbeag刺激后,th1型細胞因子ifn-γ表達水平[(75.42±7.04)、(71.59±5.55)、(101.64±9.93)]低于未刺激組(t=.86、3.15、5.88,p均0.05),明顯低于cpg-odn1826刺激組(t=-7.70、-4.94、-9.50,p均0.05),差異有統(tǒng)計學意義;有低于聯(lián)合刺激組的趨勢(t=-0.93、-0.62、-0.58,p均0.05),差異無統(tǒng)計學意義;(2)th2型細胞因子il-10表達水平[(61.67±7.42)、(54.57±7.29)、(84.96±11.74)]高于未刺激組(t=-6.87、-4.59、-7.63,p均0.05)明顯高于cpg-odn1826刺激組(t=9.33、8.23、9.61,p均0.05),差異有統(tǒng)計學意義;有高于聯(lián)合刺激組的趨勢(t=1.93、1.79、1.98,p均0.05),差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論:hbv可能通過hbeag作用于機體免疫細胞,不僅可以下調(diào)tlr9、正性共刺激分子cd83,上調(diào)負性共刺激分子pd-l1的表達,干擾免疫細胞對hbv抗原的識別以及遞呈能力來抑制非特異性免疫反應,而且可降低hbv抗原特異性T淋巴細胞活性,抑制Th1型細胞因子IFN-γ及促進Th2型細胞因子IL-10的產(chǎn)生,進而減弱特異性免疫應答能力,使HBV逃避宿主的免疫清除,其可能是導致HBV感染慢性化的機制之一。
【關(guān)鍵詞】：乙型肝炎病毒e抗原 外周血單個核細胞 Toll樣受體9 共刺激分子 溶酶體結(jié)合膜蛋白 細胞因子
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R512.62
【目錄】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-11
• 中英文縮略詞表11-13
• 第1章 前言13-15
• 第2章 材料與方法15-25
• 2.1 研究對象15
• 2.1.1 研究對象來源及入選標準15
• 2.1.2 分組方法15
• 2.2 材料15-19
• 2.2.1 基本材料15-16
• 2.2.2 主要試劑16-17
• 2.2.3 主要儀器17
• 2.2.4 主要溶液的配置17-19
• 2.3 研究方法19-24
• 2.3.1 采用Ficoll-Hypaque密度離心法，PBMC的制備19
• 2.3.2 細胞計數(shù)的方法19
• 2.3.3 臺盼藍染色細胞活力測定的方法19-20
• 2.3.4 細胞凍存20
• 2.3.5 細胞復蘇20
• 2.3.6 HBeAg與人PBMC共孵育20
• 2.3.7 流式細胞儀檢測CD83、PD-L1、CD107a、CD107b的表達20-21
• 2.3.8 RT-PCR法檢測人PBMC細胞TLR9-mRNA的表達21-23
• 2.3.9 Elisa法檢測細胞因子IFN-γ 和IL-10的表達23-24
• 2.4 統(tǒng)計方法24-25
• 第3章 結(jié)果25-40
• 3.1 最佳HBeAg溫育PBMC濃度及時間的測定25-27
• 3.2 RT-PCR法檢測不同刺激物與不同免疫狀態(tài)PBMC溫育后對TLR9-mRNA表達的影響27-28
• 3.3 流式細胞儀檢測不同刺激物與不同免疫狀態(tài)PBMC溫育后對CD14+細胞表面CD83、PD-L1表達的影響28-32
• 3.4 流式細胞儀檢測不同刺激物與不同免疫狀態(tài)PBMC溫育后對CD8+細胞表面CD107a、CD107b表達的影響32-37
• 3.5 ELISA法檢測不同刺激物與不同免疫狀態(tài)PBMC溫育后對Th1型細胞因子IFN-γ 及Th2型細胞因子IL-10的影響37-40
• 第4章 討論40-45
• 第5章 結(jié)論與展望45-46
• 5.1 結(jié)論45
• 5.2 展望45-46
• 致謝46-47
• 參考文獻47-51
• 攻讀學位期間的研究成果51-52
• 綜述52-61
• 參考文獻59-61

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 徐慶慶;韓亞萍;蔣龍鳳;劉艷;吳玉英;黨旖旎;李軍;;乙型肝炎e抗原、s抗原對Toll樣受體及共刺激分子表達的調(diào)控和影響[J];放射免疫學雜志;2012年04期

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本文編號：672224