本文關(guān)鍵詞：基于高通量測(cè)序研究基底硬度與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1對(duì)肝細(xì)胞功能的影響

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【摘要】：目的:基于高通量測(cè)序技術(shù),探究基底硬度的變化與TGF-β1對(duì)人正常肝細(xì)胞(L02)細(xì)胞功能的影響,從而研究肝細(xì)胞生物行為與肝纖維化進(jìn)程的關(guān)系,為治療肝組織病變提供新的視角。方法:以聚乙烯醇水凝膠(PVA)為基底膜,構(gòu)建與正常肝組織(4.6 kPa)、肝纖維化早期(19 kPa)、肝纖維化中后期(37 kPa)肝臟組織硬度相當(dāng)?shù)捏w外培養(yǎng)模型;在不同硬度PVA膜上培養(yǎng)L02細(xì)胞,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同硬度PVA膜上細(xì)胞凋亡比率;基于高通量測(cè)序技術(shù)篩選不同硬度基底與TGF-β1協(xié)調(diào)作用下的差異表達(dá)基因;運(yùn)用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)不同硬度基底膜上TGF-β1組與對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)和骨架構(gòu)象的變化,采用RT-PCR和Western-Blot技術(shù)檢測(cè)E-cadherin、Bata-catenin、Alpha-SMA、Vinculin、Integrinβ1、Collagen-1的基因及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:構(gòu)建了硬度可控(4.6kPa、19kPa、37kPa)的PVA膜的體外培養(yǎng)模型;L02細(xì)胞在PVA膜上培養(yǎng)48小時(shí)可呈現(xiàn)融合生長(zhǎng),不同硬度PVA膜上細(xì)胞的凋亡率均低于10%,且隨著硬度的增加,細(xì)胞凋亡程度下降,證明PVA水凝膠作為細(xì)胞培養(yǎng)基底膜具有優(yōu)良的生物學(xué)相容性,適用于L02細(xì)胞的體外培養(yǎng);細(xì)胞球形指數(shù)隨基底硬度的增加而變大,說(shuō)明基底硬度增強(qiáng)了細(xì)胞的形變能力;測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn),TGF-β1組和對(duì)照組在細(xì)胞骨架、粘附等相關(guān)方面的基因表達(dá)差異顯著,結(jié)合前期研究,篩選出差異基因E-cadherin、Bata-catenin、Alpha-SMA、Vinculin、Integrinβ1、Collagen-1;免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明隨著基底硬度的增加細(xì)胞骨架發(fā)育能力增強(qiáng),且在硬基底上出現(xiàn)明顯的纖維束和偽足,在4.6kPa的軟基底上,TGF-β1組和對(duì)照組的細(xì)胞骨架構(gòu)象并無(wú)明顯變化,但在19kPa和37k Pa較硬基底上,TGF-β1促進(jìn)了骨架的發(fā)育;基因和蛋白方面的檢測(cè)結(jié)果表示,隨著硬度的增加,E-cadherin、beta-Catenin表達(dá)量下降,Integrinβ1表達(dá)量增加,說(shuō)明其細(xì)胞粘附系統(tǒng)發(fā)生了變化,TGF-β1激活整合素系統(tǒng)加劇了這一變化;Collagen-1、Alpha-SMA的表達(dá)量在TGF-β1組隨著基底硬度的增加而顯著增加,表明TGF-β1促進(jìn)誘導(dǎo)細(xì)胞的EMT過(guò)程,在肝纖維化胞外基質(zhì)膠原沉積中發(fā)揮著重大作用。結(jié)論:本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,基底硬度的改變影響細(xì)胞的生物力學(xué)特性和生物功能,硬度的增加增強(qiáng)了TGF-β1對(duì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變,從理化協(xié)同作用的角度研究肝細(xì)胞的功能變化,為肝纖維化的機(jī)制研究提供新的視角。
【關(guān)鍵詞】：基底硬度 TGF-β1 細(xì)胞骨架
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R575.2
【目錄】：

• 中文摘要3-4
• 英文摘要4-6
• 英文縮寫詞表6-10
• 1 緒論10-22
• 1.1 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀10-19
• 1.1.1 TGF-β1 對(duì)肝纖維化的影響12-16
• 1.1.2 基底硬度對(duì)細(xì)胞功能的影響16-18
• 1.1.3 高通量測(cè)序技術(shù)18-19
• 1.2 問(wèn)題的提出及研究意義19-20
• 1.2.1 問(wèn)題的提出19-20
• 1.2.2 研究意義20
• 1.2.3 創(chuàng)新點(diǎn)20
• 1.3 研究目的與研究?jī)?nèi)容20-21
• 1.3.1 研究目的20
• 1.3.2 研究?jī)?nèi)容20-21
• 1.4 技術(shù)路線21-22
• 2 硬度可控的基底膜的制備及檢測(cè)22-34
• 2.1 引言22-23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)設(shè)備23-24
• 2.2.1 主要實(shí)驗(yàn)細(xì)胞23
• 2.2.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑23
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備23-24
• 2.2.4 試劑的配制24
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法24-28
• 2.3.1 聚乙烯醇水凝膠基底膜的制備方法24-25
• 2.3.2 聚乙烯醇水凝膠彈性模量的測(cè)定25-27
• 2.3.3 掃描電鏡觀察PVA水凝膠表面形貌27
• 2.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)27
• 2.3.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法27-28
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-33
• 2.4.1 PVA水凝膠彈性模量的測(cè)量結(jié)果28-29
• 2.4.2 掃描電鏡對(duì)聚乙烯醇水凝膠基底膜表面形貌的測(cè)定結(jié)果29-30
• 2.4.3 細(xì)胞凋亡30
• 2.4.4 細(xì)胞形態(tài)30-33
• 2.5 討論33-34
• 3 高通量測(cè)序及基因的挖掘34-47
• 3.1 引言34
• 3.2 材料與方法34-37
• 3.2.1 測(cè)序樣品準(zhǔn)備及RNA的提取34-35
• 3.2.2 RNA樣品質(zhì)量的檢測(cè)35
• 3.2.3 文庫(kù)建立及測(cè)序35-37
• 3.2.4 數(shù)據(jù)過(guò)濾處理37
• 3.3 結(jié)果與分析37-45
• 3.3.1 RNA-Seq序列數(shù)據(jù)比對(duì)與質(zhì)控分析37-39
• 3.3.2 RNA-Seq差異基因定量分析39-42
• 3.3.3 RNA-Seq功能注釋42-44
• 3.3.4 肝纖維化相關(guān)基因挖掘44-45
• 3.4 討論45-47
• 4 基底硬度和TGF-Β1 對(duì)肝細(xì)胞功能的影響47-61
• 4.1 引言47-48
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料、設(shè)備和試劑48-50
• 4.2.1 主要實(shí)驗(yàn)材料48-49
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備49
• 4.2.3 試劑的配制49-50
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法50-54
• 4.3.1 免疫熒光50
• 4.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）50-51
• 4.3.3 western blot（蛋白免疫印跡）51-54
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析54-59
• 4.4.1 基底硬度和TGF-β1 對(duì)肝細(xì)胞骨架構(gòu)象的影響54-56
• 4.4.2 基底硬度和TGF-β1 對(duì)肝細(xì)胞骨架及粘附分子的基因表達(dá)水平的測(cè)定與分析56-58
• 4.4.3 基底硬度和TGF-β1 對(duì)肝細(xì)胞骨架及粘附分子的蛋白表達(dá)水平的測(cè)定與分析58-59
• 4.5 討論59-61
• 5 結(jié)論與展望61-63
• 5.1 主要結(jié)論61
• 5.2 后續(xù)工作展望61-63
• 致謝63-64
• 參考文獻(xiàn)64-68

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：656220