本文關(guān)鍵詞：PTEN調(diào)控HCV相關(guān)胰島素抵抗及抑制DENV感染的機(jī)制研究

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【摘要】：PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted in chromosome 10,PTEN)又名MMACl、TGF-B或TEPl,是1997年發(fā)現(xiàn)定位于第10號染色體(10q23.3)上的一種抑癌基因,也是人類迄今所發(fā)現(xiàn)的唯一在體內(nèi)同時具有蛋白磷酸酶活性和脂質(zhì)磷酸酶活性的抑癌基因。在前列腺癌、乳腺癌、散發(fā)的惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤等多種腫瘤中都有很高的刪除性突變率。PTEN蛋白由403個氨基酸殘基組成,其N-末端含有磷酸酶結(jié)構(gòu)域,C-末端具有蛋白PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合序列;PTEN作為一種蛋白磷酸酶,可以使三磷酸肌醇降解,因此PTEN是一個很有效的PI3K-Akt通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子,可參與調(diào)節(jié)胰島素組織的信號傳導(dǎo)。同時,PTEN可調(diào)控哺乳動物雷帕霉素靶點(diǎn)(mammalian target of rapamycin,m TOR)的活性,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬。本文就PTEN在丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)相關(guān)胰島素抵抗中的作用以及PTEN調(diào)控自噬活性對登革病毒(dengue virus,DENV)感染性的影響作一探討,為深入理解HCV和DENV的致病機(jī)制和防治措施提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。(一)PTEN參與HCV相關(guān)胰島素抵抗及其機(jī)制研究HCV是一種主要經(jīng)過血液傳播的嗜肝性病毒,據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),全球HCV感染者約1.8億。HCV基因組具有高變異性和多種宿主免疫逃避機(jī)制使得機(jī)體難以有效清除病毒,致使約50-80%感染者發(fā)展為慢性丙型肝炎,其中20-30%將發(fā)展成肝硬化。在肝硬化患者中每年有1-4%演變?yōu)楦渭?xì)胞癌(hepatacellular carcinoma,HCC)。雖然聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林,外加最新的直接抗病毒藥物的三聯(lián)治療方案可大大提高HCV感染的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答反應(yīng),但仍面臨著治療費(fèi)用昂貴,治療時程長,副作用多等諸多問題,尚無有效疫苗問世。HCV的慢性感染可導(dǎo)致肝臟慢性炎癥、壞死及纖維化,部分患者可發(fā)展為肝硬化甚至肝癌。有研究表明,慢性丙型肝炎患者大約有25-50%存在著不同程度的糖脂代謝異常。HCV感染者發(fā)展成為胰島素抵抗(insulin resistance,IR)及2型糖尿病(type2 diabetes mellitus,T2DM)的危險(xiǎn)性越來越高。慢性HCV感染與IR緊密相關(guān),互相促進(jìn)導(dǎo)致惡性循環(huán),使這部分患者成為臨床上難治的丙型肝炎。同時,IR是肝脂肪變性、肝硬化發(fā)展的中心環(huán)節(jié),更是HCV感染所致肝癌發(fā)展過程中的一個獨(dú)立預(yù)測因素。PTEN是一種特異性蛋白酪氨酸磷酸酶,主要催化三磷酸肌醇PIP3的降解,PIP3是磷酸肌醇激酶PI3K的產(chǎn)物,可通過激活下游的Akt傳遞胰島素信號,是胰島素代謝通路的重要信號因子,促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子-4(glucose transporter-4,GLUT-4)對葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)。在3T3-L1脂肪細(xì)胞中,內(nèi)源性PTEN的作用是削弱胰島素對葡萄糖的激動作用,引起脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗。在骨骼肌細(xì)胞中,也發(fā)現(xiàn)PTEN可阻斷胰島素信號通路,產(chǎn)生胰島素抵抗。在HCV感染所導(dǎo)致的肝癌中,PTEN功能降低,同時PTEN可通過下調(diào)PI3K/Akt信號通路參與胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)HCV感染可促進(jìn)胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate-1,IRS-1)Ser307的磷酸化,加快IRS-1降解,進(jìn)而負(fù)反饋抑制胰島素信號通路IRS-1/PI3K/Akt。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),HCV感染可降低肝癌細(xì)胞系Huh7.5.1對外源胰島素刺激的敏感性,經(jīng)胰島素刺激后,HCV感染組中p Akt Ser473和p GSK3βSer9水平均明顯減弱。為探討PI3K/Akt信號通路中重要的負(fù)調(diào)控分子—PTEN是否參與了HCV相關(guān)胰島素抵抗的發(fā)生,我們檢測了不同感染復(fù)數(shù)(M.O.I=1,2,3)的HCVcc感染細(xì)胞后PTEN的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),HCV感染可明顯降低PTEN的m RNA和蛋白表達(dá)水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),PTEN過表達(dá)可下調(diào)p IRS-1Ser307水平,減緩IRS-1的降解。而在PTEN敲低組中,p IRS-1Ser307的表達(dá)水平明顯升高,IRS-1的水平明顯降低。以上結(jié)果提示HCV 2a感染所引起的p IRS-1Ser307的上調(diào)和IRS-1的下調(diào)可能是PTEN依賴的。通過構(gòu)建p JFH1-core質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染Huh7.5.1細(xì)胞,我們發(fā)現(xiàn)HCV核心蛋白可引起PTEN水平下調(diào),同時p IRS-1Ser307表達(dá)升高和IRS-1的降解,提示HCV 2a核心蛋白可下調(diào)PTEN表達(dá),同時上調(diào)p IRS-1Ser307的表達(dá),進(jìn)一步促進(jìn)胰島素信號關(guān)鍵分子IRS-1的降解,從而參與胰島素抵抗的發(fā)生。本部分研究了抑癌基因PTEN與細(xì)胞胰島素信號通路穩(wěn)態(tài)的關(guān)系,進(jìn)一步探索PTEN是否參與HCV相關(guān)胰島素抵抗的發(fā)生,及HCV核心蛋白對PTEN及細(xì)胞胰島素信號通路穩(wěn)態(tài)的影響,為研究HCV與胰島素抵抗之間相互作用提供了新的思路和治療靶點(diǎn)。(二)PTEN通過下調(diào)自噬活性抑制登革病毒感染登革病毒(dengue virus,DENV)屬于黃病毒屬,為單正鏈RNA病毒,登革病毒感染常引起自限性登革熱(dengue fever,DF),嚴(yán)重者發(fā)展為登革出血熱(dengue hemorrhagic fever,DHF)和登革休克綜合征(dengue shock syndrome,DSS)。近年來,隨著地球變暖和人口流動增加,登革病毒感染呈暴發(fā)流行趨勢,已成為一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。迄今,尚無特異性治療藥物和有效的疫苗。因此,登革病毒感染的致病機(jī)制及其防治問題仍亟待解決。細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞通過溶酶體途徑降解胞內(nèi)自身成份的過程,對維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要作用。越來越多的研究表明,自噬與病原體感染關(guān)系密切,如某些病毒可通過其編碼蛋白抑制細(xì)胞自噬,從而逃避自噬的清除作用;而包括登革病毒在內(nèi)的一些單正鏈RNA病毒卻利用自噬泡作為復(fù)制位點(diǎn),通過誘導(dǎo)自噬來促進(jìn)病毒增殖。作為m TOR信號通路的重要負(fù)調(diào)控分子,PTEN亦參與細(xì)胞對自噬的調(diào)控。然而,它是否參與登革病毒感染細(xì)胞中自噬活性的調(diào)節(jié)目前并不清楚。因此,本研究探討了登革病毒2型(DENV-2)感染人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)后,PTEN對感染細(xì)胞自噬活性的影響及其可能的作用機(jī)制。首先,我們用不同感染復(fù)數(shù)(M.O.I=0.1,0.5,1)的DENV感染HUVEC細(xì)胞48 h后,Western-blot法檢測細(xì)胞自噬標(biāo)志分子——微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)中LC3II/LC3I比值的變化。結(jié)果顯示,隨著病毒感染復(fù)數(shù)的增大,LC3II/LC3I比值增加,P62蛋白的特異性降解增加,說明DENV可誘導(dǎo)感染細(xì)胞發(fā)生自噬,自噬活性與病毒感染量呈正相關(guān)。然后,我們采用Western-blot和實(shí)時熒光定量PCR法分別檢測了細(xì)胞自噬的重要調(diào)控蛋白——PTEN在DENV感染細(xì)胞中的表達(dá)水平和m RNA含量情況。結(jié)果顯示,PTEN的蛋白表達(dá)和m RNA水平均降低,且隨著病毒感染復(fù)數(shù)的增大,下降程度越顯著。為進(jìn)一步明確PTEN對登革病毒感染及細(xì)胞自噬的可能作用機(jī)制,我們構(gòu)建了p Lenti-PTEN和p Lenti-sh PTEN慢病毒表達(dá)質(zhì)粒,借助于慢病毒包裝與感染系統(tǒng),過表達(dá)或敲低HUVEC細(xì)胞中的PTEN;該細(xì)胞經(jīng)感染DENV后,分別用Western-blot和實(shí)時熒光定量PCR法檢測細(xì)胞中DENV capsid蛋白表達(dá)情況和m RNA含量,間接免疫熒光法檢測釋放到細(xì)胞培養(yǎng)上清中的子代病毒顆粒的滴度。結(jié)果顯示,過表達(dá)的PTEN能顯著提高LC3II/LC3I的比值,促進(jìn)DENV復(fù)制和子代病毒顆粒的釋放。反之,PTEN被敲低后,細(xì)胞自噬活性受到抑制,即LC3II/LC3I比值下降,從而使細(xì)胞中的DENV復(fù)制和培養(yǎng)上清中的子代病毒顆粒含量均顯著減少,說明PTEN可能通過促進(jìn)細(xì)胞自噬而促進(jìn)DENV的生命周期。本研究結(jié)果說明,DENV感染HUVEC細(xì)胞所誘導(dǎo)的PTEN蛋白表達(dá)下調(diào)極可能是宿主細(xì)胞本身針對病毒感染的一種保護(hù)性應(yīng)答反應(yīng)。本研究結(jié)果為深入探討登革病毒與宿主細(xì)胞相互作用奠定了理論基礎(chǔ),也為登革病毒感染的防治策略提供了新思路。
【關(guān)鍵詞】：丙型肝炎病毒 PTEN 胰島素抵抗 登革病毒 PTEN 細(xì)胞自噬
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R512.63
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-11
• 英文縮略詞表11-14
• 第一部分 PTEN在HCV相關(guān)胰島素抵抗中的作用及其機(jī)制研究14-38
• 前言14-16
• 一、實(shí)驗(yàn)材料16-21
• 二、實(shí)驗(yàn)方法21-28
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-35
• 四、討論35-38
• 第二部分 PTEN 調(diào)控登革病毒 2 型感染的研究38-50
• 前言38-40
• 一、實(shí)驗(yàn)材料40
• 二、實(shí)驗(yàn)方法40-42
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果42-47
• 四、討論47-50
• 參考文獻(xiàn)50-54
• 綜述54-64
• 綜述一 丙型肝炎病毒感染與胰島素抵抗關(guān)系的研究進(jìn)展54-57
• 綜述二 細(xì)胞自噬與病毒感染關(guān)系的研究進(jìn)展57-60
• 參考文獻(xiàn)60-64
• 附錄64-65
• 致謝65

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：651765