本文關(guān)鍵詞：αSNAP調(diào)控重癥急性胰腺炎大鼠腸道緊密連接損傷的機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 急性胰腺炎 腺苷酸活化蛋白激酶 Compound C 腸道通透性 αSNAP 緊密連接 occludin

【摘要】：研究背景與目的:重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是臨床上常見的危急重癥,起病急、進(jìn)展快、病死率高。在其發(fā)病早期,可出現(xiàn)MODS(multiple organ dysfunction syndrome)和 SIRS(systemic inflammatory response syndrome)等嚴(yán)重并發(fā)癥。研究表明,SAP早期除了胰腺局部損傷外,同時(shí)伴隨大量細(xì)胞因子產(chǎn)生、激活和釋放,造成腸道緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin等表達(dá)下降,促使腸道通透性增加,腸源性感染加重,誘發(fā)和加重全身并發(fā)癥。研究證實(shí)可溶性NSF附著蛋白α(α-SNAP)可調(diào)節(jié)包括Occludin、Claudin蛋白在內(nèi)的腸道緊密連接蛋白的表達(dá),從而影響腸道通透性。已證實(shí)αSNAP對(duì)AMPK有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。本研究擬通過構(gòu)建重癥急性胰腺炎模型,檢測(cè)重癥急性胰腺炎時(shí),AMPK對(duì)腸道緊密連接蛋白的調(diào)節(jié)關(guān)系,進(jìn)而影響腸道通透性的變化,為重癥急性胰腺炎腸道屏障的保護(hù)提供理論依據(jù)。方法:1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)SD大鼠共30只,隨機(jī)分為5組,每組6只。分別給予腹腔注射20%濃度的L-精氨酸溶液2.0g/kg來誘導(dǎo)重癥急性胰腺炎(SAP組),共3組,輕癥急性胰腺炎(MAP組)1組,給予注射1.0g/kg誘導(dǎo),對(duì)照組給予腹腔注射等量生理鹽水。誘導(dǎo)成功后,將3個(gè)SAP組隨機(jī)分為重癥Compound C組(Com組)、重癥Glucosamine組(Gln組)和重癥對(duì)照組(SAP組)。Com組給予Compound C溶液2 ml灌胃,濃度為10 nm/L,每隔8h一次。Gln組給予谷氨酰胺溶液2ml灌胃,濃度為1g/kg體重·天,每隔8h一次。在最后一次注射后的24h和48h分別處死各組大鼠的一半,對(duì)大鼠胰腺和小腸上皮做HE染色,觀察其病理變化,并進(jìn)行病理評(píng)分。通過檢測(cè)腸道漏出的FITC-dextran的量,間接反映腸道通透性的變化。用免疫組化和western blot檢測(cè)AMPK、αSNAP和occludin表達(dá)水平的變化。2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)小腸上皮細(xì)胞HIEC轉(zhuǎn)染αSNAP shRNA慢病毒;通過Western blot檢測(cè)細(xì)胞AMPK、αSNAP和occludin蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1)胰腺組織病理:胰腺的HE染色中,對(duì)照組無明顯變化;MAP組大鼠胰腺組織僅見輕微充血,少量炎細(xì)胞浸潤(rùn);SAP組胰腺大片狀壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯;重癥Com組和重癥Gln組胰腺病理改變明顯輕于SAP組。在24h和48h時(shí)胰腺組織病理評(píng)分分別為:對(duì)照組(0.17±0.26,0.33±0.41);MAP 組(7.00±0.63;6.92±0.81);SAP組(14.08±0.86;14.67±0.68);Com組(12.00±0.71;12.50±0.78);Gln 組(12.67±0.88;12.17±0.82)。各組間比較p0.05。2)空腸上皮組織病理:光鏡下觀察,對(duì)照組腸黏膜未見明顯損傷,絨毛形態(tài)完整;MAP組腸絨毛稍有縮短;SAP組腸絨毛炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),絨毛形態(tài)不規(guī)則,破壞明顯,黏膜壞死脫落;重癥Com組與重癥Gln組腸黏膜相對(duì)較完整,少量壞死和腸絨毛縮短。在24h和48h小腸上皮組織病理評(píng)分分別為:對(duì)照組(1;1);MAP組(1.83±0.75;2.00±0.63);SAP 組(3.50±0.55;4.33±0.52);Com 組(3.00±0.63;3.33±0.52);Gln組(3.00±0.63;3.50±0.55)。各組間比較p0.05。3)腸道通透性檢測(cè):SAP組大鼠的腸道通透性升高明顯,重癥Com組與重癥Gln組的腸道通透性相對(duì)SAP組有所回復(fù)。24h和48h滲透出的FITC-dextran熒光值:對(duì)照組(0.22±0.14;0.51±0.61);MAP 組(99.59±5.34;102.42±5.26);SAP 組(394.17±19.93;410.25±7.80);Com 組(363.00±18.45;372.95±9.33);Gln 組(351.08±17.69;367.93±18.90)。各組間比較p0.05。4)免疫組化法(IHC)檢測(cè)腸上皮細(xì)胞蛋白表達(dá):SAP組大鼠相對(duì)于對(duì)照組和MAP組,腸上皮細(xì)胞AMPK蛋白表達(dá)升高,occludin和αSNAP蛋白表達(dá)降低;Com組和Gln組相對(duì)SAP組,腸上皮細(xì)胞中AMPK表達(dá)降低,occludin和αSNAP表達(dá)增高。5)免疫印跡(Western blot)檢測(cè)腸上皮緊密連接蛋白表達(dá):檢測(cè)造模后48h處死大鼠的腸上皮細(xì)胞,結(jié)果與免疫組化結(jié)果基本一致,SAP組大鼠腸上皮細(xì)胞AMPK表達(dá)升高,occludin和αSNAP表達(dá)降低;Com組和Gln組相對(duì)SAP組,AMPK表達(dá)降低,occludin和αSNAP表達(dá)增高。2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染αSNAP shRNA慢病毒后,HIEC細(xì)胞的αSNAP表達(dá)下調(diào),AMPK表達(dá)上調(diào),同時(shí)occludin表達(dá)也下調(diào);再向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入Compound C抑制AMPK的表達(dá),occludin的表達(dá)水平上調(diào)。結(jié)論:1.SAP大鼠的腸道上皮細(xì)胞中AMPK表達(dá)水平增高,導(dǎo)致occludin蛋白表達(dá)降低,損傷腸道中的緊密連接,增加腸屏障通透性。2.αSNAP可能通過負(fù)性調(diào)節(jié)AMPK調(diào)控occludin蛋白表達(dá)。3.Compound C以及谷氨酰胺對(duì)腸屏障有保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】：急性胰腺炎 腺苷酸活化蛋白激酶 Compound C 腸道通透性 αSNAP 緊密連接 occludin
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R576
【目錄】：

• 縮略語表5-6
• 英文摘要6-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 腺苷酸活化蛋白激酶在大鼠重癥急性胰腺炎腸道緊密連接損傷中的作用12-27
• 1.1 前言12-13
• 1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組13
• 1.3 主要試劑與儀器13-15
• 1.4 試劑配制15-16
• 1.5 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制作方法16
• 1.6 各指標(biāo)檢測(cè)及方法16-20
• 1.7 統(tǒng)計(jì)分析20
• 1.8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果20-25
• 1.9 討論25-26
• 1.10 小結(jié)26-27
• 第二章 AMPK在αSNAP調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞occludin蛋白表達(dá)中的作用27-37
• 2.1 前言27-28
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料28-29
• 2.3 試劑配制29-30
• 2.4 細(xì)胞培養(yǎng)30-31
• 2.5 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)及檢測(cè)31-34
• 2.6 統(tǒng)計(jì)分析34
• 2.7 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-35
• 2.8 討論35-36
• 2.9 小結(jié)36-37
• 全文總結(jié)37-38
• 參考文獻(xiàn)38-41
• 文獻(xiàn)綜述 腸黏膜屏障損傷與黏膜屏障保護(hù)41-52
• 參考文獻(xiàn)47-52
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文52-53
• 致謝53

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本文編號(hào)：638159