發(fā)布時間：2017-08-08 02:19

  本文關(guān)鍵詞：重組乙肝表面抗原（HBsAg）對人B淋巴母細胞系IM-9增殖的影響及其作用機制研究

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【摘要】：背景:淋巴瘤是目前發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一,B細胞淋巴瘤呈顯著上升趨勢。乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染常見于亞洲和非洲,中國是HBV感染高流行區(qū)。流行病學(xué)研究證實過去十年間持續(xù)乙肝病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)陽性的HBV感染與B細胞非何杰金淋巴瘤(Non-Hodgin’s Lymphoma,NHL)正相關(guān),HBV感染患者較未感染者發(fā)展為B細胞NHL的風(fēng)險高2~3倍。已證實慢性HBV感染增加NHL風(fēng)險,但是機制不明。許多基礎(chǔ)研究表明HBV不僅有嗜肝細胞性,也有嗜淋巴細胞性。國外學(xué)者提出了一種以HBV感染、整合以及慢性抗原刺激(chronic antigenic stimulation,CAS)與淋巴瘤生成的因果關(guān)系的多因素模型,其中HBV感染起著必要但并非充分的病原學(xué)作用。本研究用重組HBsAg刺激人類外周血淋巴母細胞系IM-9,模仿慢性乙肝病毒的HBsAg的持續(xù)刺激作用,探討慢性HBV感染發(fā)展為B細胞NHL的作用機制。方法:1.人外周血淋巴母細胞系IM-9是人類B淋巴細胞經(jīng)EB病毒(Epstein-barr virus,EBV)永生化的結(jié)果,不具有腫瘤特征,可以作為基因和功能研究。2.細胞增殖實驗(Cell proliferation assay,MTS)檢測IM-9細胞分別與不同濃度HBsAg(100 ug/mL、200 ug/mL、400 ug/mL)共孵育培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后,檢測細胞的增殖百分比。3.Annexin V-FITC/7AAD雙染法檢測細胞凋亡水平,FACS分析IM-9細胞分別與(100 ug/mL,200 ug/mL、400 ug/mL)的重組HBsAg共孵育培養(yǎng)24 h、48 h、72h后,IM-9細胞凋亡率的變化。4.westernblot法分析im-9細胞經(jīng)不同濃度hbsag(100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml)處理后,對sirt1-nf-κb信號通路關(guān)鍵分子組蛋白h3乙�；饔�、p21表達及相關(guān)凋亡蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9、bcl、bcl-xl、bax、sirt1、nf-κb的表達影響。5.酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linkedimmunosorbentassays,elisa)檢測細胞因子il-4、il-10、il-12,趨化因子ip-10、rantes水平。6.沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silentinformationregulator1,sirt1)激活劑srt1720(srt),sirt1抑制劑尼克酰胺(nicotinamide,nam)分別與200ug/mlhbsag共孵育培養(yǎng)im-9細胞48h后,檢測細胞活力、細胞凋亡水平變化,westernblot法分析hbsag誘導(dǎo)的組蛋白h3乙�；约皃21、sirt1和nf-κb的表達水平。結(jié)果:1.im-9細胞與不同濃度(100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml)的重組hbsag共孵育培養(yǎng)24h、48h、72h后,細胞增殖百分比隨hbsag濃度和時間增加而逐步上升,24h細胞增殖百分比(79.87±2.39、85.92±3.70、92.02±1.52),48h細胞增殖百分比(74.26±1.34、82.15±1.02、93.47±3.25),72h細胞增殖百分比(55.60±2.38、72.89±3.20、94.15±2.32)分別與24h對照組(pbs)(72.34±1.88),48h對照組(pbs)(61.23±2.41),72h對照組(pbs)(32.71±1.57)相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(*p0.05,**p0.01)。2.im-9細胞分別與(100ug/ml,200ug/ml、400ug/ml)的重組hbsag共孵育培養(yǎng)24h、48h、72h后,annexin-v/7-aad染色,facs(流式細胞儀)分析細胞凋亡,im-9細胞凋亡率隨著hbsag濃度及孵育時間增加而降低,24hannexinv+/7aad+凋亡率(9.34±1.15、7.57±0.46、5.97±1.02),48hannexinv+/7aad+凋亡率(8.06±0.44、5.89±1.02、4.37±0.33),72hannexinv+/7aad+凋亡率(7.27±0.19、3.92±0.86、2.17±1.03),分別與24h對照組(pbs)(13.27±2.60),48h對照組(pbs)(12.43±3.01),72h對照組(pbs)(14.51±1.11)相比,處理組與對照組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(*p0.05,**p0.01)3.im-9細胞分別與100ug/ml,200ug/ml、400ug/ml的重組hbsag共孵育培養(yǎng)48h后進行western-blot分析,與對照組(pbs)相比,隨著hbsag濃度升高組蛋白h3乙酰化作用和p21的表達降低。4.im-9細胞分別與100ug/ml,200ug/ml、400ug/ml的重組hbsag共孵育培養(yǎng)48h后western-blot分析,與對照組(pbs)相比,隨著hbsag濃度升高上調(diào)bcl-2、bcl-xl、sirt1、nf-κb的表達,下調(diào)bax的表達,caspase9水平?jīng)]有改變。5.im-9細胞分別與100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml的重組hbsag共孵育培養(yǎng)48h后humanthirty-plexantibodybeadkit檢測細胞因子il-4、il-10、il-12和趨化因子ip-10、ranet水平。hbsag引起il-4和il-10的水平升高,同時導(dǎo)致il-12、ip-10和rantes的水平下降。(100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml)的il-4(25.29±1.15、34.57±0.51、43.88±1.49)分別與對照組(pbs)(16.34±2.19)比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(*p0.05,**p0.01)。(100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml)的il-10(749.06±2.31、806.25±0.93、1010.19±1.75)分別與對照組(pbs)(601.24±1.52)比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(*p0.05,**p0.01)。(100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml)的il-12(36.14±1.27、32.53±2.79、23.77±3.10)分別與對照組(pbs)(47.82±1.31)比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(*p0.05,**p0.01)。(100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml)的ip-10(705.06±2.91、629.18±1.02、478.59±2.14)分別與對照組(pbs)(812.59±3.57)比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(*p0.05,**p0.01)。(100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml)的ranet(1788.62±3.14、1495.23±1.13、1345.70±1.09)分別與對照組(pbs)(2312.56±2.97)比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(*p0.05,**p0.01)。6.srt促進hbsag誘導(dǎo)的im-9細胞增殖,(200ug/ml+10um)hbsag+srt(94.38±2.16)分別與(200ug/ml)hbsag(83.27±1.21)、對照組(pbs)(62.35±2.31)比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(*p0.05,**p0.01)。nam抑制hbsag誘導(dǎo)的im-9細胞增殖,(200ug/ml+10um)hbsag+nam(37.48±2.02)分別與(200ug/ml)hbsag(83.27±1.21)、對照組(pbs)(62.35±2.31)比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(*p0.05,**p0.01)。srt促進hbsag誘導(dǎo)的抗凋亡活性,(200ug/ml+10um)hbsag+srt(4.71±2.03)分別與(200ug/ml)hbsag(6.53±1.61)、對照組(pbs)(12.35±3.51)比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(*p0.05,**p0.01)。nam抑制hbsag誘導(dǎo)的抗凋亡活性,(200ug/ml+10um)hbsag+nam(24.43±1.48)分別與(200ug/ml)hbsag(6.53±1.61)、對照組(pbs)(12.35±3.51)比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(*p0.05,**p0.01)。HBsAg誘導(dǎo)的組蛋白H3乙酰化和P21表達水平被SRT增強,被NAM抑制,SIRT1和NF-κB的表達水平上調(diào)被SRT增強,被NAM抑制。結(jié)論:1.HBsAg促進人外周血B淋巴樣母細胞系IM-9的增殖,且呈現(xiàn)劑量和時間依賴性,即隨濃度增加及共培養(yǎng)時間延長而作用更為顯著。2.HBsAg抑制IM-9細胞凋亡,且呈現(xiàn)劑量和時間依賴性,即隨著濃度增加及共培養(yǎng)時間延長而作用更為顯著。3.HBsAg抑制IM-9細胞組蛋白H3乙�；饔�,同時下調(diào)P21的表達水平,且呈現(xiàn)劑量依賴性,即隨濃度增加該作用更為顯著。4.HBsAg以劑量依賴方式通過上調(diào)SIRT1和NF-κB的表達水平,進一步下調(diào)Bax的表達水平從而抑制內(nèi)源性凋亡通路。同時,其上調(diào)Bcl家族抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL蛋白的表達程度,從而抑制細胞凋亡。這些數(shù)據(jù)與MTS結(jié)果一致。5.HBsAg上調(diào)Th2細胞分化的必需因子IL-4以及NHL腫瘤細胞生長的關(guān)鍵因子IL-10的血清水平,下調(diào)促進Th1細胞分化的細胞因子IL-12和趨化因子IP-10和RANTES的血清水平。Th2免疫反應(yīng)增強,Thl免疫效應(yīng)削弱,而減弱的Th1免疫反應(yīng)在抗腫瘤免疫中至關(guān)重要,從而使腫瘤細胞易于免疫逃逸。6.HBsAg誘導(dǎo)的這些反應(yīng)被SRT促進、NAM抑制�？傊�,重組HBsAg以劑量和時間依賴方式抑制人外周血B淋巴樣母細胞系IM-9凋亡,涉及多種機制:促進增殖,抑制凋亡,調(diào)節(jié)細胞因子和趨化因子,調(diào)控SIRT1-NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和組蛋白H3乙�；饔谩Ｍㄟ^重組HBsAg持續(xù)刺激模仿慢性抗原刺激,調(diào)節(jié)SIRT1-NF-κB通路促進人B淋巴母細胞系IM-9增殖。這可能是HBV相關(guān)NHL的發(fā)病機制。
【關(guān)鍵詞】：乙肝病毒(Hepatitis B virus HBV) 乙肝表面抗原(HBsAg) 非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma NHL) B淋巴樣母細胞 SIRT1 NF-κB
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R733.1;R512.62
【目錄】：

• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-14
• 前言14-18
• 1 材料和方法18-32
• 1.1 材料18-21
• 1.2 實驗方法21-31
• 1.3 統(tǒng)計學(xué)處理31-32
• 2 結(jié)果32-50
• 2.1 HBsAg促進IM-9 細胞增殖，且呈時間和劑量依賴性32-35
• 2.2 HBsAg抑制IM-9 細胞凋亡且呈劑量和時間依賴性35-41
• 2.3 HBsAg降低組蛋白H3乙酰化作用和P21的表達水平41-42
• 2.4 HBsAg上調(diào)抗凋亡Bcl家族蛋白的表達并抑制內(nèi)源性凋亡通路42-44
• 2.5 HBsAg影響多種細胞因子和趨化因子水平44-46
• 2.6 SIRT1抑制劑能顯著抑制由HBsAg誘導(dǎo)的這些反應(yīng)46-50
• 3 討論50-57
• 4 結(jié)論57-58
• 參考文獻58-63
• 綜述 乙型肝炎病毒感染與非霍奇金B(yǎng)細胞淋巴瘤63-80
• 參考文獻73-80
• 在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果80-81
• 附錄81-83
• 致謝83-84
• 個人簡歷84

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1 劉敏娟;孫靜;許云云;臧志遠;劉柳;張學(xué)光;;人B淋巴母細胞系體外培養(yǎng)方法的優(yōu)化及其影響因素[J];蘇州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2010年01期

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本文編號：637817