本文關(guān)鍵詞：PrxⅥ在大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型肺內(nèi)的表達(dá)變化

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【摘要】：肝臟是機(jī)體內(nèi)重要的代謝器官,不僅參與蛋白質(zhì)、脂肪等重要物質(zhì)代謝,還具有排泄、分泌、解毒等功能。因此,肝功能發(fā)生異常不僅會(huì)導(dǎo)致代謝紊亂還會(huì)引起其他重要器官的功能受損。肝臟的缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI)是肝臟外科手術(shù)如肝臟移植、肝部分切除等過程中經(jīng)常遇到的病理生理現(xiàn)象。有研究表明:HIRI的發(fā)生是導(dǎo)致肝功能衰竭,手術(shù)失敗,病人愈后較差的重要原因。HIRI的主要損傷機(jī)制為缺血再灌注時(shí)產(chǎn)生的大量活性氧族(reactive oxygen species:ROS)對肝臟組織細(xì)胞的過氧化損害。ROS主要包括超氧陰離子(O2-.),過氧化氫(H2O2)和羥自由基(OH.)等。ROS的化學(xué)性質(zhì)非�；顫�,可以與細(xì)胞內(nèi)和胞膜的重要結(jié)構(gòu)蛋白、功能蛋白發(fā)生過氧化反應(yīng),改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu),影響細(xì)胞功能,甚至引起細(xì)胞和組織死亡。肺臟是機(jī)體內(nèi)對氧含量非常敏感的臟器之一,當(dāng)HIRI發(fā)生時(shí),是否會(huì)引起遠(yuǎn)端臟器肺臟也處于氧化應(yīng)激狀態(tài),遭受過氧化損傷?Prx VI是近幾年發(fā)現(xiàn)的一類過氧化物酶系Peroxiredoxin(Prx)的家族成員之一。Prx VI在哺乳動(dòng)物肺部尤其是肺泡II型上皮細(xì)胞表達(dá)非常豐富。研究表明:Prx VI具有谷胱甘肽過氧化物酶的生物活性,其功能主要是負(fù)責(zé)還原H2O2和磷脂過氧化物等。用高濃度氧、百草枯、H2O2等物質(zhì)處理大鼠肺上皮細(xì)胞引起氧化應(yīng)激反應(yīng)后,Prx VI的m RNA和蛋白水平會(huì)明顯增強(qiáng)。當(dāng)誘導(dǎo)Prx VI在肺上皮細(xì)胞系過表達(dá)時(shí),能明顯增強(qiáng)細(xì)胞分解H2O2的能力,抑制細(xì)胞過氧化反應(yīng)的發(fā)生。說明:Prx VI在清除ROS,防止肺組織過氧化損傷中可能發(fā)揮重要作用。當(dāng)肝臟缺血再灌注損傷發(fā)生后,Prx VI的表達(dá)水平如何改變?未見報(bào)道。本研究通過無損傷血管夾夾閉通往大鼠肝左葉、肝中葉的血管和膽管蒂30 min后松開血管夾,制造大鼠70%肝臟缺血再灌注損傷模型,然后觀察大鼠肺內(nèi)MDA水平,Prx VI的m RNA和蛋白表達(dá)水平。探討肝臟缺血再灌注損傷后肺內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)以及Prx VI的抗氧化作用目的:觀察大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型肺內(nèi)的氧化應(yīng)激水平以及Prx VI m RNA和蛋白表達(dá)水平的改變,探討其在肺內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮的作用。方法:1肝臟缺血再灌注損傷模型的制備及取材選用健康雄性Wistar大鼠,體重200±10g,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為對照組(Con)和缺血再灌注損傷組(HIRI),用6%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.5ml/kg),參照Kohli等人的方法,分離肝血管和膽管蒂,以無創(chuàng)傷性血管夾夾閉通往肝左葉、肝中葉的血管和膽管蒂。30分鐘后去掉血管夾,恢復(fù)肝臟血液供應(yīng),制造70%肝實(shí)質(zhì)的肝臟缺血再灌注損傷模型。對照組大鼠只分離血管和膽管蒂并不夾閉。6小時(shí)后收集血液,用于ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)測定;處死大鼠取肝臟和肺,肝臟于4%多聚甲醛中固定進(jìn)行HE染色,觀察肝組織的形態(tài)學(xué)改變,肺組織置于液氮中用于Prx VI m RNA水平、蛋白水平測定以及MDA含量測定。2測定指標(biāo)及方法2.1 HE染色觀察大鼠肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)肝組織經(jīng)常規(guī)脫水、透明,石蠟包埋后,切片厚約5μm,蘇木精伊紅染色,日本產(chǎn)Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)變化并進(jìn)行圖象分析。2.2血清ALT水平測定未抗凝血經(jīng)3000rpm離心10min分離血清,血清ALT水平由全自動(dòng)生化分析儀測定。2.3肺勻漿的制備和MDA含量測定從-70℃冰箱中取出肺組織,按照10mg/100μl加入預(yù)冷的勻漿緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液,PH7.4,1mmol/L鹽酸苯甲脒,1mmol/L PMSF,0.1%Tween-20,0.5mol/L Na Cl,1mmol/L EDTANa3,5mmol/Lβ-巰基乙醇),冰浴中勻漿,勻漿液4000rpm 4℃離心20min,取上清即制成10%肺組織勻漿,肺組織勻漿內(nèi)MDA含量經(jīng)南京建成丙二醛(MDA)測定試劑盒測定2.4大鼠肺組織Prx VI m RNA水平測定用TRIzol法提取肺內(nèi)總RNA。約3μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成c DNA。以GAPDH為內(nèi)對照,進(jìn)行RT-PCR。分別以Prx VI的擴(kuò)增產(chǎn)物與GAPDH灰度值之比表示目的基因的相對表達(dá)量2.5大鼠肺組織內(nèi)Prx VI蛋白水平測定采用Western blot法測定大鼠肺內(nèi)Prx VI蛋白水平。將大鼠肺組織制成勻漿,離心后取上清。用改良Lowry法進(jìn)行蛋白總量測定.電泳的蛋白上樣量為61ug.經(jīng)過轉(zhuǎn)膜和封閉處理后,在PVDF膜上加入兔抗Prx VI抗體,室溫靜置過夜。再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記抗兔Ig G抗體.按發(fā)光試劑操作說明進(jìn)行顯影,定影,晾干。用凝膠成像系統(tǒng)掃描膠片并分析圖像,以條帶的積分光密度值表示其蛋白含量結(jié)果:1大鼠肝組織的形態(tài)學(xué)改變光學(xué)顯微鏡下可見Con組大鼠肝細(xì)胞排列成條索狀,圍繞中央靜脈成放射狀排列,肝索間肝血竇大小均勻,無明顯擴(kuò)張充血。而HIRI組大鼠的肝組織淤血嚴(yán)重,肝血竇明顯擴(kuò)張充血,肝細(xì)胞受壓萎縮,肝細(xì)胞胞漿染色變淺且有空泡出現(xiàn),部分肝細(xì)胞水腫明顯,體積增大,染色變淺。2血清ALT水平Con組大鼠血清中ALT為20.03±5.23U/L,而HIRI組血清ALT為87.43±9.06 U/L。HIRI組大鼠血清ALT水平明顯高于Con組(P0.01)。3肺勻漿內(nèi)MDA的含量Con組大鼠肺內(nèi)MDA的含量為9.81±1.89mmol/g,而HIRI組MDA含量為14.09±2.47 mmol/g。HIRI組大鼠肺內(nèi)MDA的含量明顯高于Con組(P0.01)4肺組織Prx VI m RNA相對表達(dá)量采用RT-PCR的方法測定大鼠肺組織內(nèi)抗氧化酶Prx VI m RNA的表達(dá)量。計(jì)算與內(nèi)參照的比值得出相對表達(dá)量進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。分析表明:HIRI組大鼠肺組織內(nèi)的Prx VI m RNA水平均明顯高于Con組(P0.01)。說明HIRI組大鼠肺組織內(nèi)Prx VI表達(dá)升高。5大鼠肺組織內(nèi)Prx VI的蛋白水平HIRI組大鼠肺組織內(nèi)Prx VI的蛋白表達(dá)水平(1.02±0.19)明顯高于對照組(0.65±0.13)(P0.01)。結(jié)論:1結(jié)扎肝左、中血管和膽管蒂可成功建立大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型。2大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型肺組織中MDA含量增加,Prx VI的基因水平、蛋白水平均明顯增強(qiáng),提示:肺組織已遭受過氧化損傷,Prx VI參與了氧化應(yīng)激反應(yīng)
【關(guān)鍵詞】：肝臟缺血再灌注損傷模型 過氧化酶VI 丙二醛 氧化應(yīng)激 活性氧族
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R575
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 前言13-14
• 材料與方法14-22
• 結(jié)果22-23
• 附圖23-30
• 附表30-33
• 討論33-34
• 結(jié)論34
• 參考文獻(xiàn)34-37
• 綜述 肝臟缺血再灌注損傷的氧化還原療法37-50
• 參考文獻(xiàn)43-50
• 致謝50-51
• 個(gè)人簡歷51

【參考文獻(xiàn)】

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1 曹建明;張佳雷;牛愛清;秦建斌;;大鼠急性肝缺血-再灌注時(shí)心肌細(xì)胞氧化損傷及瑞芬太尼的干預(yù)作用[J];臨床麻醉學(xué)雜志;2011年01期

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本文編號：629573