本文關(guān)鍵詞：丙酮酸乙酯對(duì)膽汁淤積性肝纖維化的作用及其機(jī)制的研究

  更多相關(guān)文章： EP 肝纖維化 Nrf2信號(hào)通路 抗氧化蛋白 炎癥因子 HSP27

【摘要】：肝纖維化是各種慢性肝病的共同病理基礎(chǔ),以細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積為特征。氧化應(yīng)激在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用。丙酮酸乙酯(EP)作為近年發(fā)現(xiàn)的一種新的有效抗氧化、抗炎物質(zhì),尤其是EP對(duì)膽汁淤積性肝纖維化的治療作用目前尚未明確。目的(1)本實(shí)驗(yàn)采用膽管結(jié)扎(BDL)制備大鼠肝纖維化模型,并通過血清學(xué)和組織病理學(xué)檢測(cè)證實(shí)肝功能損傷及纖維化病理改變;(2)觀察EP干預(yù)后肝纖維化大鼠的肝功能改變及肝臟組織病理學(xué)改變;(3)觀察EP干預(yù)后Nrf2和SOD2的蛋白表達(dá)情況,并檢測(cè)Nrf2及其介導(dǎo)的抗氧化蛋白的mRNA表達(dá)變化;(4)觀察EP干預(yù)后HMGB1、IL-1β、TNF-α及HSP27的mRNA變化,并探討EP延緩肝纖維化進(jìn)展的分子機(jī)制。材料與方法70只SD雄性大鼠隨機(jī)分成3組:假手術(shù)組(Sham,n=6);膽管結(jié)扎組(BDL,n=37);膽管結(jié)扎并給予EP治療組(EP,n=37),BDL和EP組又分別分為2w(n=10),4w(n=12)和6w(n=15)3個(gè)亞組。BDL組和EP組進(jìn)行膽管結(jié)扎端離,Sham組進(jìn)行相同的手術(shù),膽管不結(jié)扎端離,EP組腹腔注射EP40mg/kg每日一次。BDL組和EP組分別在造模2w、4w、6w時(shí)分批處死大鼠,Sham組在6w時(shí)處死大鼠收集血清及肝臟標(biāo)本做以下檢測(cè):(1)采用丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒檢測(cè)血清中ALT和AST的濃度,以此來評(píng)估肝功能損傷程度。(2)肝臟石蠟切片HE染色觀察肝組織病理形態(tài)變化、Masson膠原染色觀察纖維改變。(3)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)Nrf2、SOD2、a-SMA、HMGB1、HSP27的表達(dá)情況。(4)rt-pcr檢測(cè)nrf2信號(hào)通路抗氧化蛋白的mrna表達(dá)情況,炎癥因子和hsp27的mrna表達(dá)情況。(5)用nrf2elisa試劑盒檢測(cè)肝組織內(nèi)nrf2蛋白活性,western-blot技術(shù)檢測(cè)肝組織內(nèi)sod2蛋白含量。(6)應(yīng)用生物信息學(xué)方法檢測(cè)nrf2和hsp27基因之間的相關(guān)性。(7)運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件spssstatistics22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用單因素方差分析方法來比較均值,p0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果(1)本實(shí)驗(yàn)采用膽管結(jié)扎法成功建立大鼠肝纖維化模型。肝功能檢測(cè)顯示造模2w、4w及6w時(shí)血清alt、ast均顯著升高,表明肝功能受損;ep干預(yù)后血清alt、ast顯著下降,其中2w和4w時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;(2)elisa與westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示,與sham組相比,bdl組和ep組肝組織中nrf2、sod2含量均顯著升高,而ep組大鼠肝組織中nrf2、sod2含量較bdl組高,其中4w時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;(3)rt-pcr檢測(cè)結(jié)果顯示,與bdl組相比,ep組大鼠肝組織中nrf2、sod2、nqo1及gsh-px表達(dá)均顯著增加,而hmgb1、il-1β、tnf-α及hsp27表達(dá)則顯著降低。(4)生物信息學(xué)方法提示nrf2和hsp27基因之間通過轉(zhuǎn)錄因子jun和鋅指蛋白36(bzfp36l1)存在間接聯(lián)系。結(jié)論(1)在bdl術(shù)后2w和4w時(shí),ep干預(yù)可減輕肝纖維化指標(biāo)改變,表明ep在膽汁淤積性肝纖維化中具有抑制肝纖維化的作用。(2)bdl術(shù)后2w和4w時(shí),ep干預(yù)可以促進(jìn)nrf2、sod2nqo1和gsh-px表達(dá)。表明ep在膽汁淤積性肝纖維化早期、中期可以提高nrf2及其介導(dǎo)的抗氧化蛋白的活性,而肝硬化期作用不明顯。(3)在膽汁淤積性肝纖維化中,HMGB1、IL-β和TNF-α表達(dá)上調(diào),而EP可以抑制這些基因的表達(dá),表明EP在膽汁淤積性肝纖維化中可以減輕炎癥反應(yīng)。(4)在膽汁淤積性肝纖維化中,HSP27的表達(dá)增強(qiáng),而EP可以抑制HSP27的表達(dá),EP的抗肝纖維化作用可能與其有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：EP 肝纖維化 Nrf2信號(hào)通路 抗氧化蛋白 炎癥因子 HSP27
【學(xué)位授予單位】：成都醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R575.2
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-15
• 第一部分 膽管結(jié)扎誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型的建立15-33
• 1 實(shí)驗(yàn)材料15-18
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物15-16
• 1.2 主要儀器和設(shè)備16
• 1.3 主要試劑16-17
• 1.4 試劑配制17-18
• 2 實(shí)驗(yàn)方法18-24
• 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與動(dòng)物模型的建立19-20
• 2.3 血清學(xué)檢測(cè)20
• 2.4 石蠟切片的制作及染色20-22
• 2.5 肝纖維化病理分期標(biāo)準(zhǔn)22
• 2.6 Real Time PCR22-24
• 2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理24
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-30
• 3.1 實(shí)驗(yàn)大鼠一般情況觀察分析24-25
• 3.2 血清ALT、AST濃度變化25-26
• 3.3 實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織的病理變化26-28
• 3.4 實(shí)驗(yàn)大鼠肝纖維化的病理分期28-29
• 3.5 實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織內(nèi)CollagenI表達(dá)變化29
• 3.6 實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織內(nèi)HSCS的改變29-30
• 4 討論30-33
• 4.1 肝纖維化動(dòng)物模型的建立30-31
• 4.2 EP對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠肝功能的影響31
• 4.3 EP對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠肝纖維化指標(biāo)的影響31-33
• 第二部分 丙酮酸乙酯干預(yù)后Nrf2-ARE信號(hào)通路的表達(dá)變化33-45
• 1 實(shí)驗(yàn)材料33-36
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物33
• 1.2 主要儀器與設(shè)備33-35
• 1.4 試劑配制35-36
• 2 實(shí)驗(yàn)方法36-39
• 2.1 組織免疫組化36
• 2.2 Nrf2 ELISA試劑盒檢測(cè)36-37
• 2.3 Western blotting分析37-38
• 2.4 Real Time -PCR38-39
• 2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理39
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-42
• 3.1 EP對(duì)肝纖維化大鼠肝組織內(nèi)Nrf2通路的影響39-42
• 4 討論42-45
• 4.1 膽汁淤積性肝纖維化時(shí)氧化應(yīng)激水平升高42-43
• 4.2 EP對(duì)Nrf2抗氧化通路的影響43-45
• 第三部分 丙酮酸乙酯干預(yù)后炎癥介質(zhì)及其HSP27的變化45-51
• 1 實(shí)驗(yàn)材料45
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物45
• 2 實(shí)驗(yàn)技術(shù)45-46
• 2.1 Real Time PCR45-46
• 2.2 生物信息學(xué)方法46
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理46
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果46-50
• 3.1 EP對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中HMGB1表達(dá)變化46-47
• 3.2 EP對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中IL-1β 和TNF-α 表達(dá)變化47-48
• 3.3 EP對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中HSP27表達(dá)的影響48-49
• 3.4 生物信息學(xué)分析結(jié)果49-50
• 4 討論50-51
• 4.1 EP抑制了炎癥因子的表達(dá)50-51
• 4.2 EP可能通過HSP27增強(qiáng)了Nrf2-ARE通路的活性51
• 全文總結(jié)51-53
• 參考文獻(xiàn)53-57
• 文獻(xiàn)綜述57-67
• 參考文獻(xiàn)63-67
• 附錄67-69
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果69-70
• 致謝70

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本文編號(hào)：612247