本文關鍵詞：丙酮酸乙酯對膽汁淤積性肝纖維化的作用及其機制的研究

  更多相關文章： EP 肝纖維化 Nrf2信號通路 抗氧化蛋白 炎癥因子 HSP27

【摘要】：肝纖維化是各種慢性肝病的共同病理基礎,以細胞外基質(ECM)沉積為特征。氧化應激在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用。丙酮酸乙酯(EP)作為近年發(fā)現的一種新的有效抗氧化、抗炎物質,尤其是EP對膽汁淤積性肝纖維化的治療作用目前尚未明確。目的(1)本實驗采用膽管結扎(BDL)制備大鼠肝纖維化模型,并通過血清學和組織病理學檢測證實肝功能損傷及纖維化病理改變;(2)觀察EP干預后肝纖維化大鼠的肝功能改變及肝臟組織病理學改變;(3)觀察EP干預后Nrf2和SOD2的蛋白表達情況,并檢測Nrf2及其介導的抗氧化蛋白的mRNA表達變化;(4)觀察EP干預后HMGB1、IL-1β、TNF-α及HSP27的mRNA變化,并探討EP延緩肝纖維化進展的分子機制。材料與方法70只SD雄性大鼠隨機分成3組:假手術組(Sham,n=6);膽管結扎組(BDL,n=37);膽管結扎并給予EP治療組(EP,n=37),BDL和EP組又分別分為2w(n=10),4w(n=12)和6w(n=15)3個亞組。BDL組和EP組進行膽管結扎端離,Sham組進行相同的手術,膽管不結扎端離,EP組腹腔注射EP40mg/kg每日一次。BDL組和EP組分別在造模2w、4w、6w時分批處死大鼠,Sham組在6w時處死大鼠收集血清及肝臟標本做以下檢測:(1)采用丙氨酸轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)試劑盒檢測血清中ALT和AST的濃度,以此來評估肝功能損傷程度。(2)肝臟石蠟切片HE染色觀察肝組織病理形態(tài)變化、Masson膠原染色觀察纖維改變。(3)免疫組織化學染色檢測Nrf2、SOD2、a-SMA、HMGB1、HSP27的表達情況。(4)rt-pcr檢測nrf2信號通路抗氧化蛋白的mrna表達情況,炎癥因子和hsp27的mrna表達情況。(5)用nrf2elisa試劑盒檢測肝組織內nrf2蛋白活性,western-blot技術檢測肝組織內sod2蛋白含量。(6)應用生物信息學方法檢測nrf2和hsp27基因之間的相關性。(7)運用統(tǒng)計學軟件spssstatistics22.0進行數據分析,采用單因素方差分析方法來比較均值,p0.05作為統(tǒng)計學檢驗的標準。結果(1)本實驗采用膽管結扎法成功建立大鼠肝纖維化模型。肝功能檢測顯示造模2w、4w及6w時血清alt、ast均顯著升高,表明肝功能受損;ep干預后血清alt、ast顯著下降,其中2w和4w時有統(tǒng)計學意義;(2)elisa與westernblot檢測結果顯示,與sham組相比,bdl組和ep組肝組織中nrf2、sod2含量均顯著升高,而ep組大鼠肝組織中nrf2、sod2含量較bdl組高,其中4w時有統(tǒng)計學差異;(3)rt-pcr檢測結果顯示,與bdl組相比,ep組大鼠肝組織中nrf2、sod2、nqo1及gsh-px表達均顯著增加,而hmgb1、il-1β、tnf-α及hsp27表達則顯著降低。(4)生物信息學方法提示nrf2和hsp27基因之間通過轉錄因子jun和鋅指蛋白36(bzfp36l1)存在間接聯系。結論(1)在bdl術后2w和4w時,ep干預可減輕肝纖維化指標改變,表明ep在膽汁淤積性肝纖維化中具有抑制肝纖維化的作用。(2)bdl術后2w和4w時,ep干預可以促進nrf2、sod2nqo1和gsh-px表達。表明ep在膽汁淤積性肝纖維化早期、中期可以提高nrf2及其介導的抗氧化蛋白的活性,而肝硬化期作用不明顯。(3)在膽汁淤積性肝纖維化中,HMGB1、IL-β和TNF-α表達上調,而EP可以抑制這些基因的表達,表明EP在膽汁淤積性肝纖維化中可以減輕炎癥反應。(4)在膽汁淤積性肝纖維化中,HSP27的表達增強,而EP可以抑制HSP27的表達,EP的抗肝纖維化作用可能與其有關。
【關鍵詞】：EP 肝纖維化 Nrf2信號通路 抗氧化蛋白 炎癥因子 HSP27
【學位授予單位】：成都醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R575.2
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-15
• 第一部分 膽管結扎誘導大鼠肝纖維化模型的建立15-33
• 1 實驗材料15-18
• 1.1 實驗動物15-16
• 1.2 主要儀器和設備16
• 1.3 主要試劑16-17
• 1.4 試劑配制17-18
• 2 實驗方法18-24
• 2.1 實驗動物分組與動物模型的建立19-20
• 2.3 血清學檢測20
• 2.4 石蠟切片的制作及染色20-22
• 2.5 肝纖維化病理分期標準22
• 2.6 Real Time PCR22-24
• 2.7 統(tǒng)計學處理24
• 3 實驗結果24-30
• 3.1 實驗大鼠一般情況觀察分析24-25
• 3.2 血清ALT、AST濃度變化25-26
• 3.3 實驗大鼠肝組織的病理變化26-28
• 3.4 實驗大鼠肝纖維化的病理分期28-29
• 3.5 實驗大鼠肝組織內CollagenI表達變化29
• 3.6 實驗大鼠肝組織內HSCS的改變29-30
• 4 討論30-33
• 4.1 肝纖維化動物模型的建立30-31
• 4.2 EP對實驗大鼠肝功能的影響31
• 4.3 EP對實驗大鼠肝纖維化指標的影響31-33
• 第二部分 丙酮酸乙酯干預后Nrf2-ARE信號通路的表達變化33-45
• 1 實驗材料33-36
• 1.1 實驗動物33
• 1.2 主要儀器與設備33-35
• 1.4 試劑配制35-36
• 2 實驗方法36-39
• 2.1 組織免疫組化36
• 2.2 Nrf2 ELISA試劑盒檢測36-37
• 2.3 Western blotting分析37-38
• 2.4 Real Time -PCR38-39
• 2.5 統(tǒng)計學處理39
• 3 實驗結果39-42
• 3.1 EP對肝纖維化大鼠肝組織內Nrf2通路的影響39-42
• 4 討論42-45
• 4.1 膽汁淤積性肝纖維化時氧化應激水平升高42-43
• 4.2 EP對Nrf2抗氧化通路的影響43-45
• 第三部分 丙酮酸乙酯干預后炎癥介質及其HSP27的變化45-51
• 1 實驗材料45
• 1.1 實驗動物45
• 2 實驗技術45-46
• 2.1 Real Time PCR45-46
• 2.2 生物信息學方法46
• 2.3 統(tǒng)計學處理46
• 3 實驗結果46-50
• 3.1 EP對肝纖維化大鼠肝組織中HMGB1表達變化46-47
• 3.2 EP對肝纖維化大鼠肝組織中IL-1β 和TNF-α 表達變化47-48
• 3.3 EP對肝纖維化大鼠肝組織中HSP27表達的影響48-49
• 3.4 生物信息學分析結果49-50
• 4 討論50-51
• 4.1 EP抑制了炎癥因子的表達50-51
• 4.2 EP可能通過HSP27增強了Nrf2-ARE通路的活性51
• 全文總結51-53
• 參考文獻53-57
• 文獻綜述57-67
• 參考文獻63-67
• 附錄67-69
• 攻讀學位期間的研究成果69-70
• 致謝70

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