本文關(guān)鍵詞：華支睪吸蟲溶血磷脂酶與肝纖維化發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景與目標(biāo)肝纖維化是機(jī)體應(yīng)對慢性肝細(xì)胞損傷發(fā)起的過度修復(fù)反應(yīng),需要肝星狀細(xì)胞(HSCs)、炎癥細(xì)胞和免疫細(xì)胞的參與。作為引起全球發(fā)病率和死亡率的一個主要原因,目前臨床上尚無特異性抗纖維化治療的藥物。華支睪吸蟲病是一種由華支睪吸蟲感染引起的食源性寄生蟲病,流行于東亞以及東南亞地區(qū),也是我國流行廣泛、影響人們生活質(zhì)量的食源性寄生蟲病之一。華支睪吸蟲成蟲寄生在宿主的肝內(nèi)膽管,長時間的寄生造成宿主肝臟的慢性損傷,引起一系列的肝膽管疾病。在這一系列的肝膽管疾病中,華支睪吸蟲感染引起的肝纖維化,我們對于其發(fā)生機(jī)制所知甚少。溶血磷脂酶(Lyso PLA)作為磷脂酶家族的成員之一,存在于多種哺乳動物的組織和細(xì)胞、寄生蟲以及細(xì)菌中。溶血磷脂酶除了發(fā)揮水解溶血磷脂的生理功能外,在寄生蟲和真菌致病過程中也發(fā)揮著重要作用。在華支睪吸蟲中,我們克隆表達(dá)出了溶血磷脂酶,發(fā)現(xiàn)其不但發(fā)揮催化磷脂的酶活性,而且能活化人肝星狀細(xì)胞系LX-2細(xì)胞。提示我們?nèi)A支睪吸蟲溶血磷脂酶(Cs Lyso PLA)與華支睪吸蟲感染所致的肝纖維化過程可能存在著聯(lián)系。因此本研究主要對華支睪吸蟲溶血磷脂酶在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的作用及機(jī)制進(jìn)行初步探討,為華支睪吸蟲病的防治提供新的理論依據(jù)。研究方法1.Cs Lyso PLA免疫血清的制備用重組的Cs Lyso PLA與弗氏完全佐劑(初次免疫)或弗氏不完全佐劑(加強(qiáng)免疫)等體積混合,經(jīng)腹部皮下多點(diǎn)注射免疫SD大鼠、經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射免疫新西蘭兔,每隔兩周加強(qiáng)免疫一次,共兩次,每次免疫之前和末次免疫兩周后大鼠尾靜脈取血和兔耳緣靜脈取血,分離血清。2.Cs Lyso PLA在華支睪吸蟲囊蚴感染BALB/c小鼠肝臟和血清中的表達(dá)囊蚴經(jīng)灌胃感染BALB/c小鼠0、7、30、60、90、135和180天,分別取其肝臟和血液。將肝臟進(jìn)行包埋、切片,對肝組織切片進(jìn)行Cs Lyso PLA免疫組織化學(xué)染色;將血液離心取血清,ELISA檢測Cs Lyso PLA含量。3.Cs Lyso PLA尾靜脈注射BALB/c小鼠Cs Lyso PLA尾靜脈注射BALB/c小鼠,每周兩次,共18周。肝臟進(jìn)行包埋、切片或液氮速凍;血液離心取血清。4.Cs Lyso PLA尾靜脈注射BALB/c小鼠肝組織炎癥浸潤和纖維化情況對Cs Lyso PLA尾靜脈注射BALB/c小鼠肝組織切片分別進(jìn)行HE和Masson染色,光學(xué)顯微鏡下觀察炎癥浸潤和纖維化情況。5.Cs Lyso PLA尾靜脈注射BALB/c小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的檢測將Cs Lyso PLA尾靜脈注射BALB/c小鼠的血清,按照血清ALT和AST檢測試劑盒的說明進(jìn)行檢測。6.Cs Lyso PLA尾靜脈注射BALB/c小鼠肝組織α-SMA、Collagen-I的檢測提取Cs Lyso PLA尾靜脈注射BALB/c小鼠液氮速凍肝組織的總蛋白,Western bloting檢測α-SMA、Collagen-I的表達(dá);并對肝組織切片進(jìn)行α-SMA免疫熒光染色,熒光顯微鏡下觀察,α-SMA染成紅色。7.華支睪吸蟲囊蚴感染和Cs Lyso PLA尾靜脈注射的BALB/c小鼠IL-25的表達(dá)按照IL-25的ELISA檢測試劑盒說明檢測華支睪吸蟲囊蚴感染和Cs Lyso PLA尾靜脈注射的BALB/c小鼠血清IL-25含量;對兩組小鼠肝組織切片進(jìn)行IL-25的免疫組織化學(xué)染色,光學(xué)顯微鏡下觀察;提取Cs Lyso PLA尾靜脈注射BALB/c小鼠液氮速凍的肝組織的總蛋白,Western bloting檢測IL-25的表達(dá)。8.Cs Lyso PLA尾靜脈注射的BALB/c小鼠肝組織IL-25和CD68免疫熒光雙染對Cs Lyso PLA尾靜脈注射BALB/c小鼠肝組織切片進(jìn)行IL-25和CD68免疫熒光雙染色,熒光顯微鏡下觀察,IL-25陽性細(xì)胞呈綠色,CD68陽性細(xì)胞呈紅色。9.Cs Lyso PLA刺激小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞分泌IL-25的檢測將Cs Lyso PLA與小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞孵育,提取總RNA和總蛋白,Q-PCR檢測IL-25的m RNA的表達(dá);Western bloting和細(xì)胞免疫熒光染色檢測IL-25的蛋白表達(dá)。10.RAW264.7細(xì)胞分泌IL-25信號通路的檢測24孔板中Cs Lyso PLA(10μg/ml)過濾除菌后加或不加H-89(20μM)或SC79(4μg/ml)刺激RAW264.7 24h;12孔板中,H-89(20μM)提前60min加入刺激細(xì)胞,再加入Cs Lyso PLA(10μg/ml)刺激15、30、60和90min;或SC79(4μg/ml)提前30min加入刺激細(xì)胞,再加入Cs Lyso PLA(10μg/ml)刺激15min、30min;PBS為陰性對照。11.IL-25對人肝星狀細(xì)胞系LX-2細(xì)胞的作用IL-25在體外與LX-2細(xì)胞孵育,提取總RNA,Q-PCR檢測α-SMA的m RNA水平;提取總蛋白,Western bloting檢測α-SMA的蛋白水平;LX-2細(xì)胞爬片免疫熒光染色檢測Collagen-I的表達(dá);Transwell小室法觀察IL-25對LX-2細(xì)胞遷移能力的影響。12.Cs Lyso PLA對TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞活化的作用將Cs Lyso PLA先于LX-2細(xì)胞孵育,再加TGF-β1刺激,提取LX-2細(xì)胞總的RNA,Q-PCR檢測α-SMA、MMP2、Collagen-I的m RNA水平;提取總蛋白,Western bloting檢測α-SMA的蛋白水平以及信號通路分子Smad3、JNK2、ERK1/2的活化水平;LX-2細(xì)胞爬片免疫熒光染色檢測α-SMA的表達(dá);CCK-8法檢測LX-2細(xì)胞增殖能力的影響;Transwell小室法觀察對LX-2細(xì)胞遷移能力的影響。研究結(jié)果1.華支睪吸蟲感染BALB/c小鼠的肝組織免疫組織化學(xué)染色顯示Cs Lyso PLA在感染30d時檢測到表達(dá),在60d和90d表達(dá)量最大,隨著感染時間的延長表達(dá)量減少。ELISA檢測血清中Cs Lyso PLA的表達(dá),發(fā)現(xiàn)感染30d成蟲分泌開始增加,90d分泌量達(dá)到最高,隨著成蟲在體內(nèi)存活時間的延長其分泌逐漸減少。Cs Lyso PLA在肝組織和血清中表達(dá)的變化趨勢與華支睪吸蟲感染小鼠不同階段肝臟膠原纖維的變化情況一致,提示Cs Lyso PLA與C.sinensis感染所致的肝纖維化存在著關(guān)聯(lián)性。2.對Cs Lyso PLA尾靜脈注射BALB/c小鼠肝組織進(jìn)行HE和Masson染色,結(jié)果顯示肝組織有著明顯的炎癥細(xì)胞浸潤和纖維膠原沉積,并且從靜脈周圍延伸至肝實(shí)質(zhì)內(nèi)。用賴氏法檢測血清中肝細(xì)胞損傷指標(biāo)ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)和AST(天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)的活力,顯示Cs Lyso PLA作用后的血清中ALT和AST活力水平顯著的高于對照組,表明Cs Lyso PLA可引起肝臟的損傷。3.對Cs Lyso PLA尾靜脈注射BALB/c小鼠的肝組織進(jìn)行HSCs活化標(biāo)志α-SMA和Collagen-I的檢測。Western bloting結(jié)果發(fā)現(xiàn)α-SMA和Collagen-I在Cs Lyso PLA尾靜脈注射BALB/c小鼠的肝組織中高表達(dá);肝組織的α-SMA免疫熒光染色顯示Cs Lyso PLA尾靜脈注射組可見大量α-SMA染色陽性細(xì)胞,對照組未見,以上結(jié)果表明Cs Lyso PLA注射后可引起肝星狀細(xì)胞的活化。4.為了研究IL-25是否與Cs Lyso PLA誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的形成有聯(lián)系,對華支睪吸蟲感染小鼠的血清進(jìn)行檢測,ELISA結(jié)果顯示在感染7d時,血清中IL-25的含量顯著高于對照組,60d時達(dá)到峰值,隨著感染時間的延長IL-25含量減少,并且這種變化趨勢與肝臟纖維化形成趨勢一致。此外又對華支睪吸蟲感染小鼠肝組織進(jìn)行IL-25的免疫組織化學(xué)染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組未見到IL-25陽性細(xì)胞,華支睪吸蟲感染組散在分布著IL-25陽性細(xì)胞。在Cs Lyso PLA尾靜脈注射組,血清中IL-25雖然與對照組相比IL-25含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異,但是我們利用Western bloting檢測到IL-25在Cs Lyso PLA尾靜脈注射組肝組織中的表達(dá),并且免疫組織化學(xué)染色檢測結(jié)果顯示Cs Lyso PLA尾靜脈注射組肝組織中分布著IL-25陽性細(xì)胞,而對照組則未見到。提示IL-25與Cs Lyso PLA尾靜脈注射小鼠肝纖維化的形成有關(guān)系。5.為了檢測IL-25的分泌細(xì)胞,對Cs Lyso PLA尾靜脈注射BALB/c小鼠肝組織進(jìn)行IL-25與巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志分子CD68熒光雙染,免疫熒光染色可見IL-25和CD68染色雙陽性的細(xì)胞,說明IL-25與CD68分子共染在巨噬細(xì)胞上,提示Cs Lyso PLA尾靜脈后可刺激肝臟的巨噬細(xì)胞分泌IL-25。6.為了進(jìn)一步驗(yàn)證IL-25的分泌細(xì)胞,用Cs Lyso PLA刺激小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7,分別利用Q-PCR、Western bloting和細(xì)胞免疫熒光技術(shù)在m RNA和蛋白水平檢測IL-25的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)Cs Lyso PLA能夠刺激RAW264.7細(xì)胞分泌IL-25。隨后又對分泌IL-25的相關(guān)信號通路進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)了RAW264.7細(xì)胞分泌IL-25是由PKA依賴的Braf-ERK1/2信號通路介導(dǎo)的。7.HSCs的活化是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié),為了研究IL-25與肝纖維化的關(guān)系,用IL-25刺激人肝星狀細(xì)胞系LX-2細(xì)胞。在m RNA水平,與對照組相比,IL-25誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞活化標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)增高;Western Bloting結(jié)果顯示α-SMA的蛋白在IL-25和TGF-β1刺激下表達(dá)量均有顯著性的增高。為了驗(yàn)證NF-κB對α-SMA表達(dá)的影響,加入NF-κB抑制劑-BAY11-7083,發(fā)現(xiàn)與IL-25單刺激組相比,α-SMA的蛋白表達(dá)量下降。說明IL-25可能是通過NF-κB相關(guān)的信號通路刺激LX-2細(xì)胞的活化。此外,在IL-25刺激LX-2細(xì)胞后,利用Western Bloting和細(xì)胞免疫熒光染色技術(shù)對Collagen-I進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)IL-25刺激后Collagen-I的表達(dá)顯著高于對照組。此外我們又發(fā)現(xiàn)IL-25能夠促進(jìn)LX-2細(xì)胞遷移。8.TGF-β1是一種強(qiáng)有效的促肝纖維化的細(xì)胞因子,但是我們實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Cs Lyso PLA能夠減低TGF-β1活化LX-2細(xì)胞的α-SMA、MMP2、Collagen-I基因的m RNA水平;抑制TGF-β1活化LX-2細(xì)胞的α-SMA蛋白的表達(dá);并且這種抑制是通過減弱TGF-β1相關(guān)的信號分子Smad3、JNK2、ERK1/2的磷酸化實(shí)現(xiàn)的;此外Cs Lyso PLA還抑制TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2的增殖和遷移。研究結(jié)論Cs Lyso PLA一方面刺激宿主巨噬細(xì)胞分泌IL-25,IL-25通過激活HSCs發(fā)揮促纖維化的作用;另一方面通過抑制Smad3、JNK、ERK的磷酸化,從而抑制TGF-β1活化HSCs的功能。Cs Lyso PLA究竟是發(fā)揮促纖維化作用或抑制纖維化的作用,可能與華支睪吸蟲感染的時段、感染度和反復(fù)感染狀態(tài)以及宿主免疫功能等因素相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：肝纖維化 華支睪吸蟲溶血磷脂酶 肝星狀細(xì)胞 巨噬細(xì)胞 IL-25
【學(xué)位授予單位】：中山大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R575.2;R532.23
【目錄】：

• 中文摘要3-9
• 英文摘要9-15
• 英文縮略詞15-18
• 前言18-21
• 第一章 Cs Lyso PLA誘導(dǎo)IL-25 介導(dǎo)的肝纖維化形成21-66
• 第一節(jié) Cs Lyso PLA在華支睪吸蟲囊蚴感染BALB/c小鼠體內(nèi)表達(dá)21-31
• 1 材料21-23
• 2 方法23-26
• 3 結(jié)果26-29
• 4 討論29-30
• 5 小結(jié)30-31
• 第二節(jié) Cs Lyso PLA誘導(dǎo)BALB/c小鼠肝纖維化的形成31-40
• 1 材料31-32
• 2 方法32-35
• 3 結(jié)果35-38
• 4 討論38-39
• 5 小結(jié)39-40
• 第三節(jié) Cs Lyso PLA誘導(dǎo)肝纖維化的形成與巨噬細(xì)胞分泌的IL-25 有關(guān)40-66
• 1 材料40-41
• 2 方法41-49
• 3 結(jié)果49-63
• 4 討論63-65
• 5 小結(jié)65-66
• 第二章 Cs Lyso PLA抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的LX-2 細(xì)胞的活化66-75
• 1 材料66-67
• 2 方法67-68
• 3 結(jié)果68-73
• 4 討論73-74
• 5 小結(jié)74-75
• 全文總結(jié)75-76
• 參考文獻(xiàn)76-84
• 附錄84-85
• 致謝85

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本文編號：602592