發(fā)布時間：2017-07-31 23:27

  本文關(guān)鍵詞：胸腺B細(xì)胞在Treg發(fā)育中的作用研究及NK細(xì)胞在原發(fā)性膽汁性肝硬化致病機制中的研究

  更多相關(guān)文章： 胸腺B細(xì)胞 胸腺Treg細(xì)胞 發(fā)育 共刺激分子 抗原遞呈分子 細(xì)胞-細(xì)胞間接觸 原發(fā)性膽汁性肝硬化 dnTGF-βR Ⅱ小鼠 NK細(xì)胞 CD4~+T細(xì)胞 DX5~-NK細(xì)胞 負(fù)調(diào)功能

【摘要】：第一部分胸腺B細(xì)胞在Treg發(fā)育中的作用及機制研究 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是一群對于維持機體免疫耐受和免疫穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要的CD4+T細(xì)胞,特異性表達轉(zhuǎn)錄因子FoxP3。 Treg參與多種疾病的發(fā)病,并在其中發(fā)揮重要作用,如自身免疫性疾病、感染、過敏和腫瘤等。因為Treg細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)中扮演了重要角色,將Treg細(xì)胞作為疾病治療的靶點極具臨床應(yīng)用前景,而探究Treg細(xì)胞的發(fā)育機制無疑為Treg細(xì)胞用于臨床疾病治療提供重要的基礎(chǔ)理論參考。 外周免疫系統(tǒng)中的FoxP3+Treg細(xì)胞根據(jù)其來源的不同可以分為外周誘導(dǎo)產(chǎn)生的Treg細(xì)胞(p-Treg)和胸腺來源的Treg田胞(t-Treg), p-Treg細(xì)胞是在外周由經(jīng)典的非Treg的CD4+T細(xì)胞在特定免疫微環(huán)境中誘導(dǎo)產(chǎn)生,而t-Treg細(xì)胞是在胸腺中由CD4單陽性胸腺細(xì)胞發(fā)育而來,t-Treg是構(gòu)成外周FoxP3+Treg細(xì)胞的主要成分。 t-Treg在胸腺中的發(fā)育主要分為兩個階段：第一個階段是從CD4單陽性T細(xì)胞在經(jīng)過TCRβ-MHC II和CD28-CD80/86選擇和刺激后生成CD25+FoxP3-Treg前體細(xì)胞；第二個階段是從Treg前體細(xì)胞向成熟Foxp3+Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,這個過程是細(xì)胞因子IL-2所依賴的。在t-Treg的發(fā)育過程中,多種抗原遞呈細(xì)胞,如：樹突狀細(xì)胞,胸腺髓質(zhì)區(qū)上皮細(xì)胞促進了t-Treg的發(fā)育和分化。胸腺B細(xì)胞也是正常存在于胸腺組織的一種抗原遞呈細(xì)胞,但其在胸腺發(fā)育中的作用,特別是在t-Treg發(fā)育中的作用仍然不清楚,因此,我們將探究胸腺B細(xì)胞在t-Treg發(fā)育過程中所行使的功能,從而深刻認(rèn)識Treg細(xì)胞的發(fā)育機理。我們已取得的實驗結(jié)果如下： 1.胸腺B細(xì)胞參與胸腺Treg的發(fā)育 通過免疫組化染色我們發(fā)現(xiàn),胸腺B細(xì)胞和胸腺Treg細(xì)胞均定位于胸腺的髓質(zhì)區(qū)；流式分析B細(xì)胞敲除的FoxP3-GFP小鼠胸腺細(xì)胞時,發(fā)現(xiàn)胸腺中B細(xì)胞的缺失不影響CD4單陽性和CD8單陽性胸腺細(xì)胞,但胸腺Treg細(xì)胞的比例和數(shù)目均顯著的下降；同時,我們利用體外胸腺B細(xì)胞和胸腺CD4單陽性細(xì)胞共培養(yǎng)的實驗直接證實了胸腺B細(xì)胞能夠誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生。 2.胸腺B細(xì)胞通過細(xì)胞-細(xì)胞間的接觸的方式促進胸腺Treg細(xì)胞發(fā)育 通過體外培養(yǎng)實驗,我們發(fā)現(xiàn)胸腺B細(xì)胞促進胸腺Treg細(xì)胞的發(fā)育是細(xì)胞-細(xì)胞間的接觸所依賴的,而與胸腺B細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子無關(guān)；進一步的實驗分析,我們發(fā)現(xiàn)胸腺B細(xì)胞促進胸腺Treg細(xì)胞發(fā)育所依賴的細(xì)胞-細(xì)胞間接觸是由胸腺B細(xì)胞表面的MHCⅡ分子和CD40,CD80和CD86這些共刺激分子所介導(dǎo)的。 3.胸腺B細(xì)胞促進CD4單陽性胸腺細(xì)胞生成Treg前體細(xì)胞 在體外胸腺B細(xì)胞和胸腺Treg前體細(xì)胞共培養(yǎng)的實驗中,我們發(fā)現(xiàn)胸腺B細(xì)胞不具備誘導(dǎo)胸腺Treg前體細(xì)胞向成熟Foxp3+Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力；相反,在胸腺B細(xì)胞和胸腺CD4單陽性細(xì)胞共培養(yǎng)的實驗中,我們發(fā)現(xiàn)胸腺B細(xì)胞顯著的促進了胸腺CD4單陽性細(xì)胞生成Treg前體細(xì)胞。 4.胸腺B細(xì)胞的參與促進胸腺Treg細(xì)胞增殖 在分析B細(xì)胞敲除的FoxP3-GFP小鼠胸腺中Treg細(xì)胞時,我們發(fā)現(xiàn)胸腺B細(xì)胞的缺失導(dǎo)致了處在增殖狀態(tài)的胸腺Treg細(xì)胞比例顯著下降；另外在胸腺Treg細(xì)胞體外增殖的培養(yǎng)實驗中,我們發(fā)現(xiàn)胸腺B細(xì)胞的加入能夠顯著的促進胸腺Treg細(xì)胞的增殖。 5.胸腺B細(xì)胞表面的MHC Ⅱ分子和CD40/CD80/86分子在促進胸腺Treg細(xì)胞增殖中扮演不同的角色 在胸腺B細(xì)胞和胸腺Treg細(xì)胞共培養(yǎng)的實驗中加入表面分子的特異性阻斷抗體,阻斷由這些分子所介導(dǎo)的信號傳遞,我們發(fā)現(xiàn)胸腺B細(xì)胞所提供的MHCⅡ分子參與到促進胸腺Treg細(xì)胞增殖中,但胸腺B細(xì)胞來源的CD40、CD80和CD86這些共刺激分子并不參與其中。 綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)胸腺B細(xì)胞在胸腺Treg細(xì)胞發(fā)育過程中的作用及其作用機制,闡明了胸腺B細(xì)胞主要是通過兩種機制來維持胸腺Treg細(xì)胞的正常數(shù)目,第一個機制是促進胸腺Treg細(xì)胞的發(fā)育,第二個機制是促進成熟胸腺Treg細(xì)胞的增殖,這些發(fā)現(xiàn)加深了我們對t-Treg發(fā)育的認(rèn)識。 第二部分NK細(xì)胞在原發(fā)性膽汁性肝硬化致病機制中作用及機制的研究 原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)是由于自身免疫系統(tǒng)攻擊肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞而引起的慢性膽汁淤積性肝臟疾病,該自身免疫疾病的病理學(xué)特征為：肝內(nèi)中小膽管的破壞,匯管區(qū)炎癥細(xì)胞的浸潤。PBC病人肝臟匯管區(qū)浸潤的淋巴細(xì)胞有B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,同時還包含有NK細(xì)胞。至今我們都在密切關(guān)注適應(yīng)性免疫細(xì)胞在PBC疾病發(fā)生中的作用,并取得了多個研究成果,卻鮮見針對天然免疫細(xì)胞,特別是NK細(xì)胞在該疾病發(fā)生中作用的研究。肝臟是一個天然免疫占優(yōu)勢的器官,NK細(xì)胞做為天然免疫細(xì)胞在肝臟中含量很高,人肝臟淋巴細(xì)胞中NK細(xì)胞約占25%-40%,在鼠中也有10%-20%的含量。 在我們以前的工作中發(fā)現(xiàn)PBC病人的外周血和肝臟中NK細(xì)胞的比例和數(shù)目均是顯著的增加：并且相對于健康的對照組,來自于病人的NK細(xì)胞體外殺傷能力以及穿孔素的表達均顯著性增強,但NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力卻顯著下降。雖然以上這些結(jié)果顯示了PBC病人中NK細(xì)胞的表型發(fā)生了顯著性改變,但是NK細(xì)胞在該疾病發(fā)生中的作用以及NK細(xì)胞與其他效應(yīng)細(xì)胞的作用仍然不清楚。在此研究中,我們以dnTGF-βRⅡ模型小鼠做為研究對象,來揭示NK細(xì)胞在PBC樣疾病發(fā)生中的作用及其機制。已取得的結(jié)果如下： 1.在dnTGF-βRⅡ鼠中,肝臟NK細(xì)胞抑制自身免疫性膽管炎 對NK細(xì)胞和肝臟炎癥的數(shù)據(jù)進行線性回歸分析,我們發(fā)現(xiàn)在dnTGF-βRⅡ鼠中,肝臟NK細(xì)胞比例與肝臟中單個核細(xì)胞的數(shù)目呈負(fù)相關(guān)性；進一步我們發(fā)現(xiàn)在dnTGF-βRⅡ鼠中敲除NK細(xì)胞顯著的加重了肝臟匯管區(qū)淋巴細(xì)胞的浸潤和肝內(nèi)膽管的破壞。 2.肝臟NK細(xì)胞通過抑制肝臟CD4+T細(xì)胞反應(yīng)來抑制肝臟炎癥 我們發(fā)現(xiàn)在dnTGF-βRⅡ鼠中敲除NK細(xì)胞顯著的增加了肝臟CD4+T細(xì)胞的數(shù)目；進一步我們利用轉(zhuǎn)輸誘導(dǎo)膽管炎模型,將脾臟中的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞共轉(zhuǎn)輸?shù)絉ag1-/-或者NK-/-Rag1-/-小鼠體內(nèi),發(fā)現(xiàn)NK-/-Rag-/-小鼠肝臟中顯著增加的是CD4+T細(xì)胞,而不是CD8+T細(xì)胞。 3.肝臟DX5-NK細(xì)胞作為CD4+T細(xì)胞的負(fù)性調(diào)節(jié)因子 利用體外CD4+T細(xì)胞增殖抑制實驗,我們確定肝臟DX5-NK細(xì)胞具有抑制CD4+T細(xì)胞增殖的能力,相反肝臟DX5+NK細(xì)胞具有促進CD4+T細(xì)胞增殖的潛能；同時,我們還發(fā)現(xiàn)肝臟DX5NK細(xì)胞的比例與肝臟單個核細(xì)胞數(shù)目和肝臟CD4+T細(xì)胞比例均呈顯著的負(fù)相關(guān)性。 總之,我們揭示了肝臟NK細(xì)胞在dnTGF-βRⅡ模型小鼠肝臟炎癥中的免疫負(fù)調(diào)功能,這種負(fù)調(diào)功能是通過抑制肝臟CD4+T細(xì)胞來實現(xiàn)的；進一步我們闡明了兩種不同肝臟NK細(xì)胞亞群在PBC樣疾病發(fā)生中的不同功能。這些發(fā)現(xiàn)加深了我們對PBC發(fā)病機制的認(rèn)識。
【關(guān)鍵詞】：胸腺B細(xì)胞 胸腺Treg細(xì)胞 發(fā)育 共刺激分子 抗原遞呈分子 細(xì)胞-細(xì)胞間接觸 原發(fā)性膽汁性肝硬化 dnTGF-βR Ⅱ小鼠 NK細(xì)胞 CD4~+T細(xì)胞 DX5~-NK細(xì)胞 負(fù)調(diào)功能
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R575.22
【目錄】：

• 摘要5-9
• ABSTRACT9-14
• 符號說明14-16
• 圖序16-18
• 目錄18-22
• 第一部分 胸腺B細(xì)胞在Treg發(fā)育過程中的作用及機制研究22-76
• 第一章 Treg細(xì)胞胸腺發(fā)育和分化研究進展緒論22-42
• 1.1 前言22-23
• 1.2 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的概述23-29
• 1.2.1 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的概況23-24
• 1.2.2 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)育和分化24-27
• 1.2.3 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能27-29
• 1.3 抗原遞呈細(xì)胞在胸腺來源的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)育過程中作用的研究29-33
• 1.3.1 髓質(zhì)區(qū)上皮細(xì)胞在胸腺來源的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)育過程中作用及其機制29-31
• 1.3.2 樹突狀細(xì)胞在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)育過程中的作用及其機制31-33
• 1.4 胸腺B細(xì)胞的概述33-40
• 1.4.1 胸腺B細(xì)胞的特性33-36
• 1.4.2 胸腺B細(xì)胞的發(fā)育和分化36-38
• 1.4.3 胸腺B細(xì)胞的功能38-40
• 1.5 特色及創(chuàng)新之處40-42
• 第二章 實驗材料及方法42-60
• 2.1 實驗材料42-46
• 2.1.1 小鼠信息42
• 2.1.2 實驗試劑42-46
• 2.2 主要實驗儀器46-47
• 2.3 實驗方法47-60
• 2.3.1 病理制片47-49
• 2.3.2 免疫組化染色49-50
• 2.3.3 免疫熒光染色50-51
• 2.3.4 小鼠胸腺/脾臟單個核細(xì)胞分離51-52
• 2.3.5 流式檢測細(xì)胞表面及胞內(nèi)分子52
• 2.3.6 BrdU細(xì)胞摻入實驗52-53
• 2.3.7 細(xì)胞分選53-55
• 2.3.8 細(xì)胞培養(yǎng)實驗55-58
• 2.3.9 統(tǒng)計學(xué)分析方法58-60
• 第三章 實驗結(jié)果60-76
• 3.1 引言60-61
• 3.2 胸腺B細(xì)胞和胸腺Treg細(xì)胞在胸腺中共定位61-62
• 3.3 胸腺B細(xì)胞處在高度活化的狀態(tài)62
• 3.4 胸腺B細(xì)胞高表達趨化因子受體CCR662-63
• 3.5 胸腺B細(xì)胞的增殖能力增強63-64
• 3.6 胸腺B細(xì)胞缺失后胸腺Treg的比例和數(shù)目下降64-65
• 3.7 胸腺B細(xì)胞能夠促進胸腺CD4單陽性細(xì)胞生成Treg細(xì)胞65-66
• 3.8 胸腺B細(xì)胞具有與胸腺DC細(xì)胞相同的促進Treg產(chǎn)生的能力66-67
• 3.9 胸腺B細(xì)胞促進胸腺Treg細(xì)胞產(chǎn)生不依賴于分泌的細(xì)胞因子67-68
• 3.10 胸腺B細(xì)胞促進胸腺Treg細(xì)胞產(chǎn)生依賴于MHC Ⅱ分子以及共刺激分子CD40/CD80/CD86所介導(dǎo)的細(xì)胞與細(xì)胞間接觸68-69
• 3.11 胸腺B細(xì)胞能夠促進胸腺pre-Treg細(xì)胞生成,但不能促進pre-Treg細(xì)胞向成熟Foxp3~+Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化69-70
• 3.12 胸腺B細(xì)胞能夠促進胸腺Treg細(xì)胞的增殖70-71
• 3.13 胸腺B細(xì)胞促進胸腺Treg細(xì)胞增殖依賴于MHC Ⅱ分子所介導(dǎo)的接觸而不依賴CD40/CD80/CD86所介導(dǎo)的共刺激71-72
• 3.14 小結(jié)與討論72-76
• 第二部分 NK在PBC模型鼠疾病發(fā)生中的作用及機制研究76-102
• 第四章 NK在PBC模型鼠疾病發(fā)生中的作用及機制76-102
• 4.1 實驗材料76-78
• 4.1.1 小鼠信息76
• 4.1.2 實驗試劑76-78
• 4.2 實驗方法78-85
• 4.2.1 病理制片及H&E染色78-80
• 4.2.2 小鼠肝臟及脾臟單個核細(xì)胞分離80
• 4.2.3 流式檢測細(xì)胞表面分子及細(xì)胞因子分泌能力80-81
• 4.2.4 肝臟組織蛋白提取,BCA定量81
• 4.2.5 CBA檢測81-82
• 4.2.6 細(xì)胞分選82-83
• 4.2.7 體外NK細(xì)胞的抑制實驗83-84
• 4.2.8 ELISA(AMA濃度的檢測)84
• 4.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析方法84-85
• 4.3 實驗結(jié)果85-102
• 4.3.1 引言85-86
• 4.3.2 dnTGF-β RⅡ模型小鼠中肝臟炎癥的嚴(yán)重程度與NK細(xì)胞的數(shù)目呈負(fù)相關(guān)86-87
• 4.3.3 NK細(xì)胞缺失后,dnTGF-βRⅡ模型小鼠自身免疫性膽管炎加重87-88
• 4.3.4 NK細(xì)胞缺失的dnTGF-βRⅡ模型小鼠血清AMAs的濃度升高88-89
• 4.3.5 NK細(xì)胞缺失后,dnTGF-βRⅡ模型小鼠體內(nèi)炎性細(xì)胞因子的濃度增加89-90
• 4.3.6 NK細(xì)胞缺失后,dnTGF-βRⅡ模型小鼠中CD4~+T細(xì)胞反應(yīng)增強90-92
• 4.3.7 在轉(zhuǎn)輸誘導(dǎo)膽管炎模型中NK細(xì)胞能夠抑制肝臟炎癥92-93
• 4.3.8 在轉(zhuǎn)輸誘導(dǎo)膽管炎模型中NK細(xì)胞表現(xiàn)出具有抑制CD4~+T細(xì)胞反應(yīng)的功能93
• 4.3.9 在體外dnTGF-β RⅡ模型小鼠中肝臟NK細(xì)胞能夠促進CD4~+T細(xì)胞的增殖93-95
• 4.3.10 dnTGF-βRⅡ模型小鼠中DX5~+和DX5~-兩個肝臟NK細(xì)胞亞群的表型差異95
• 4.3.11 dnTGF-βRⅡ模型小鼠中肝臟DX5~-NK細(xì)胞抑制CD4~+T細(xì)胞的增殖95-97
• 4.3.12 結(jié)果與討論97-102
• 參考文獻102-114
• 致謝114-116
• 在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與其他研究成果116-118
• 附錄118-122

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 SHI YaoYao;ZHU MingZhao;;Medullary thymic epithelial cells,the indispensable player in central tolerance[J];Science China(Life Sciences);2013年05期

，

本文編號：601609