本文關鍵詞：MiR-19b調控腸上皮細胞SOCS3表達在腸粘膜損傷修復中的作用

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【摘要】：【研究背景與目的】炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease,IBD)包括潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis,UC)和克羅恩病(Crohn's disease,CD),其病因和發(fā)病機制尚未完全明確。腸黏膜免疫紊亂是導致IBD發(fā)生、發(fā)展和影響其轉歸的決定性因素,而腸上皮細胞在維持腸免疫穩(wěn)態(tài)中具有重要的作用。目前調控腸上皮細胞發(fā)揮腸黏膜免疫穩(wěn)態(tài)功能的分子機制尚不清楚。近期研究表明,IBD患者存在特異的miRNAs表達譜,miRNA可在轉錄后水平抑制靶基因的表達,參與IBD的發(fā)病。細胞因子信號抑制物3(Suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)可通過對腸上皮細胞(Intestinal epithelial cell,IEC)信號傳導及轉錄激活因子3(Signal transducers and activators of transcription,STAT3)的表達調控,介導細胞增殖過程,影響炎癥過程中的粘膜愈合,是炎癥持續(xù)活動的生物學標志。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)miR-19b在CD患者腸粘膜組織的病變部位較正常人明顯下降,而SOCS3的蛋白表達較正常人明顯升高,且細胞實驗驗證miR-19b可以靶向調控SOCS3的表達。本課題旨在:通過小鼠結腸炎模型進一步驗證miR-19b在腸道炎癥形成中的作用;并通過免疫組化、miRNA原位雜交及細胞實驗探討miR-19b靶向調控腸上皮細胞SOCS3的表達對STAT3活性的影響及其對IEC增殖的作用�！痉椒ā�1.選取6~8周雌性BALB/c小鼠,給予三硝基苯磺酸(2,4,6-Trinitro-benzene-sulfonic acid,TNBS)灌腸,誘導建立小鼠結腸炎模型。2.TNBS造模成功后,給予小鼠miR-19b類似物灌腸,免疫熒光檢測外源性輸注的miR-19b在腸粘膜中的分布,并觀察各組小鼠腸道炎癥的變化,檢測腸組織中miR-19b及SOCS3的表達水平。3.原位雜交技術(In situ hybridization,ISH)檢測CD患者及正常對照組腸上皮細胞中miR-19b的表達。4.免疫組化(Immunohistochemistry,IHC)檢測CD患者及正常對照組腸上皮細胞中STAT3及磷酸化STAT3(Phosphorylated-STAT3,p-STAT3)的表達。5.熒光素酶報告基因實驗(Luciferase reporter assay)分析HT-29細胞中miRNA與SOCS3 3’非翻譯區(qū)(UTR)的結合情況。6.過表達或抑制HT-29細胞中的miR-19b后,采用Western blotting及q RT-PCR分別檢測SCOS3蛋白和信使RNA(Messenger RNA,mRNA)的表達情況。7.過表達或抑制HT-29細胞中的miR-19b后,給予Interleukin-6(IL-6)刺激細胞30min,Western blotting檢測細胞STAT3及p-STAT3的表達水平。8.過表達或抑制HT-29細胞中的miR-19b后,給予IL-6刺激細胞24h,q RT-PCR及Western blotting分別檢測STAT3的下游基因細胞周期素cyclin D1的mRNA和蛋白的變化。9.過表達或抑制HT-29細胞中的miR-19b后,給予IL-6刺激細胞24h,用流式細胞技術及CCK8檢測細胞細胞周期及增殖能力的變化�！窘Y果】1.BALB/c小鼠經TNBS灌腸后形成結腸炎模型。與乙醇對照組相比,TNBS模型組小鼠的DAI評分增加,腸道炎癥加重,HE組織病理評分增加。提示造模成功。2.小鼠TNBS造模成功后,結腸中miR-19b水平較對照組降低,SOCS3蛋白表達較對照組增加。再給予miR-19b類似物灌腸,免疫熒光顯示外源性輸注的miR-19b可進入腸上皮細胞內。治療組中小鼠的DAI評分較造模組有所下降,HE組織評分降低,腸道炎癥減輕,提示結腸中miR-19b的水平與小鼠的腸道炎癥程度成負相關。檢測各組小鼠結腸組織中miR-19b及SOCS3的表達,發(fā)現(xiàn)經miR-19b類似物灌腸治療后小鼠結腸中miR-19b水平升高,SOCS3蛋白降低,SOCS3 mRNA在各組小鼠結腸組織中無明顯差異。提示miR-19b可以改善TNBS小鼠結腸的炎性損傷,可能與轉錄后調控SOCS3的表達相關。3.原位雜交結果顯示miR-19b在活動期CD患者腸上皮細胞中低表達,與前期研究中PCR的檢測結果一致。4.活動期CD患者病變腸上皮細胞中STAT3蛋白表達水平與正常對照組腸上皮細胞相比無明顯差異,而p-STAT3的表達較對照組明顯降低。5.在HT-29細胞中,熒光素酶報告基因實驗結果提示miR-19b可以與SOCS3 mRNA的3’UTR特異性結合。6.過表達或抑制HT-29細胞中的miR-19b,可降低或升高SOCS3蛋白水平,而SOCS3 mRNA水平不受影響。提示在HT-29細胞中,miR-19b可在轉錄后水平抑制SOCS3的表達。7.在HT-29細胞中過表達或抑制miR-19b,可升高或下降STAT3蛋白的磷酸化水平,而STAT3的總蛋白水平不受影響。8.過表達HT-29細胞中的miR-19b可促進STAT3磷酸化,可增加下游基因cyclin D1的表達;降低miR-19b可抑制STAT3的磷酸化,可減少cyclin D1的表達。9.過表達HT-29細胞中的miR-19b能夠誘導細胞G1/S期轉化,促進細胞增殖;下調HT-29細胞中的miR-19b則減少細胞G1/S期的轉化,抑制細胞增殖�！窘Y論】miR-19b的低表達及SOCS3的高表達存在于CD患者及TNBS誘導的結腸炎小鼠中。給予miR-19b類似物后,可減低TNBS小鼠結腸的炎性損傷,提示異常表達的miR-19b及SOCS3可能與腸道的炎癥形成相關,參與CD的發(fā)病。體外細胞實驗提示miR-19b可靶向調控SOCS3的表達,影響p-STAT3/cyclin D1的表達,調節(jié)細胞周期及細胞增殖,從而影響CD患者損傷腸粘膜的修復,參與CD的發(fā)生發(fā)展。
【關鍵詞】：克羅恩病 miR-19b SOCS3 p-STAT3 腸黏膜修復
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R574.62
【目錄】：

• 略縮語中英文對照表5-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 材料及方法16-34
• 結果34-45
• 討論45-50
• 結論50-51
• 參考文獻51-59
• 綜述 miRNA在炎癥性腸病的病因、診斷及治療中的作用59-71
• 參考文獻66-71
• 攻讀學位期間發(fā)表論文情況71-72
• 致謝72

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