本文關(guān)鍵詞：毛囊源性iPS細(xì)胞經(jīng)定行內(nèi)胚層誘導(dǎo)為肝細(xì)胞樣細(xì)胞的研究

  更多相關(guān)文章： 干細(xì)胞 iPS細(xì)胞 定行內(nèi)胚層 肝細(xì)胞樣細(xì)胞 細(xì)胞治療

【摘要】：背景眾所周知,i PS細(xì)胞具有與ES細(xì)胞相似的形態(tài)、基因表型及多向分化、自我更新能力,并且回避了ES細(xì)胞所面臨的倫理學(xué)的困擾。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)i PS細(xì)胞肝向誘導(dǎo)的成功案例,但是仍有許多問(wèn)題亟待解決。首先,靶細(xì)胞的選擇是至關(guān)重要的。國(guó)內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)室使用的i PS細(xì)胞的重編程靶細(xì)胞為:皮膚成纖維細(xì)胞、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、臍帶血來(lái)源CD34+細(xì)胞和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞等,其中最常見(jiàn)的是皮膚成纖維細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)新性地重編程毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞為i PS細(xì)胞,建立了毛囊源性i PS細(xì)胞系,具有取材廣泛、安全、簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)。其次,傳統(tǒng)的誘導(dǎo)方法是通過(guò)擬胚體(EB)階段進(jìn)行i PS細(xì)胞的肝向誘導(dǎo)。擬胚體途徑的主要目的是模擬體內(nèi)的胚胎發(fā)育過(guò)程,擬胚體中的三胚層細(xì)胞可以互相支持、互相提供細(xì)胞生長(zhǎng)分化所必需的微環(huán)境。但是,由于擬胚體的特殊三維立體結(jié)構(gòu),其分化后的細(xì)胞處于不同的分化階段,限制了所得成體細(xì)胞臨床應(yīng)用的可能性;擬胚體不僅可以分化為肝細(xì)胞,亦可分化為胰腺細(xì)胞,降低了細(xì)胞的純度;經(jīng)由擬胚體得到的細(xì)胞壽命較短。因此,我們必須探索出一個(gè)新的誘導(dǎo)途徑,以達(dá)到i PS細(xì)胞高效肝向誘導(dǎo)的目的。本實(shí)驗(yàn)繞過(guò)擬胚體階段,經(jīng)由定行內(nèi)胚層階段,模擬體內(nèi)肝細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育模式,促使i PS細(xì)胞向肝細(xì)胞樣細(xì)胞方向分化。本方案顯著提高了i PS細(xì)胞體外肝向誘導(dǎo)的效率、細(xì)胞的壽命及細(xì)胞的數(shù)量。最后,目前已有的誘導(dǎo)方法仍存在效率較低這個(gè)致命的問(wèn)題,因此我們?cè)谡T導(dǎo)方法上進(jìn)行了優(yōu)化改良。我們將HGF應(yīng)用于i PS細(xì)胞的肝向誘導(dǎo)中,在誘導(dǎo)的早期,加入了大劑量的HGF,從而有效地促進(jìn)了定行內(nèi)胚層形成,遵循了高效性的原則。方法本實(shí)驗(yàn)選擇毛囊源性i PS細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,對(duì)其進(jìn)行體外誘導(dǎo),繞過(guò)擬胚體階段,經(jīng)過(guò)定行內(nèi)胚層向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化,并對(duì)所得細(xì)胞進(jìn)行鑒定。本實(shí)驗(yàn)具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):(1)本實(shí)驗(yàn)室重編程毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞,構(gòu)建了新的毛囊源性i PS細(xì)胞系,細(xì)胞的來(lái)源更加豐富,且取材更加安全、無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)便;(2)與傳統(tǒng)誘導(dǎo)方法相比,我們繞過(guò)了擬胚體階段,經(jīng)定行內(nèi)胚層進(jìn)行i PS細(xì)胞的肝向誘導(dǎo),提高了細(xì)胞的純度與壽命,確保實(shí)驗(yàn)的有效性、高效性;(3)我們?cè)谡T導(dǎo)的初期使用了大劑量的HGF,從而促進(jìn)了i PS細(xì)胞向定行胚層(DE)的誘導(dǎo)分化,增加了DE形成的比例。結(jié)果本實(shí)驗(yàn)選用毛囊源性i PS細(xì)胞為對(duì)象,相差顯微鏡觀察其細(xì)胞呈克隆樣排列;RT-PCR證實(shí)其不表達(dá)DE、HLCs的特異性標(biāo)記基因。經(jīng)過(guò)4天誘導(dǎo)后的定行內(nèi)胚層細(xì)胞,相差顯微鏡觀察其細(xì)胞連接斷裂,細(xì)胞體積變大;RT-PCR證實(shí)有DE的特異性標(biāo)記基因SOX17、FOXa2的表達(dá);免疫熒光染色提示其在蛋白水平上有SOX17的表達(dá)。我們得到的HLCs經(jīng)相差顯微鏡觀察可知其細(xì)胞體積較大,呈多角形,細(xì)胞核呈圓形;RT-PCR證實(shí)具有肝細(xì)胞特異性標(biāo)記基因ALB,AFP,HNF4α,AAT,CYP3A4和CK18的表達(dá);免疫熒光染色表明其在蛋白水平上表達(dá)ALB,AFP,CYP3A4和CYP7A1;功能鑒定提示HLCs具有糖原貯存、LDL攝取和ICG攝入和排泄功能。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)選擇毛囊源性i PS細(xì)胞為靶細(xì)胞,取材安全無(wú)創(chuàng)。在誘導(dǎo)方法上,我們首先選擇了經(jīng)定行內(nèi)胚層進(jìn)行誘導(dǎo),避免了擬胚體階段,從而提高了細(xì)胞壽命和誘導(dǎo)效率,其次,我們?cè)谡T導(dǎo)的初期加入大劑量的HGF,大大促進(jìn)了定行內(nèi)胚層的形成,從而保證i PS細(xì)胞能夠迅速、有效的向肝細(xì)胞樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化。通過(guò)我們的方法,可以大量地生產(chǎn)i PS源性肝細(xì)胞樣細(xì)胞,為廣大的肝衰病人帶來(lái)福音和生命的希望。
【關(guān)鍵詞】：干細(xì)胞 iPS細(xì)胞 定行內(nèi)胚層 肝細(xì)胞樣細(xì)胞 細(xì)胞治療
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R575
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 英文縮略詞表8-13
• 第1章 引言13-24
• 1.1 iPS細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)13-15
• 1.2 iPS細(xì)胞的分化潛能15-16
• 1.3 肝臟疾病細(xì)胞治療的現(xiàn)狀16-18
• 1.4 iPS細(xì)胞在肝臟疾病中的應(yīng)用潛能18-19
• 1.5 iPS細(xì)胞向肝細(xì)胞定向分化的誘導(dǎo)方案19-22
• 1.5.1 iPS細(xì)胞向定行內(nèi)胚層細(xì)胞分化20-21
• 1.5.2 iPS細(xì)胞肝向分化21
• 1.5.3 iPS源性肝細(xì)胞功能的成熟21-22
• 1.5.4 iPS源性肝細(xì)胞樣細(xì)胞的特征及功能評(píng)估22
• 1.6 研究前景與面臨問(wèn)題22-24
• 第2章 材料與方法24-35
• 2.1 材料24-26
• 2.1.1 主要儀器和設(shè)備24-25
• 2.1.2 主要試劑25-26
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法26-35
• 2.2.1 iPS細(xì)胞的復(fù)蘇26-27
• 2.2.2 挑取克隆27
• 2.2.3 鋪制飼養(yǎng)層27-28
• 2.2.4 iPS細(xì)胞的傳代28-29
• 2.2.5 iPS細(xì)胞的凍存29
• 2.2.6 iPS細(xì)胞體外誘導(dǎo)29-31
• 2.2.7 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）31-32
• 2.2.8 免疫熒光染色32-33
• 2.2.9 糖原染色（PAS染色）33
• 2.2.10 LDL攝取實(shí)驗(yàn)33-34
• 2.2.11 ICG攝取與排泄實(shí)驗(yàn)34-35
• 第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-46
• 3.1 毛囊源性iPS細(xì)胞經(jīng)定行內(nèi)胚層向肝細(xì)胞樣細(xì)胞的誘導(dǎo)35
• 3.2 定行內(nèi)胚層的形成35-36
• 3.3 定行內(nèi)胚層特異基因表達(dá)36-37
• 3.4 定行內(nèi)胚層蛋白水平表達(dá)情況37-39
• 3.5 定行內(nèi)胚層向肝細(xì)胞樣細(xì)胞(HLCS)的誘導(dǎo)39
• 3.6 肝細(xì)胞樣細(xì)胞(HLCS)的特異性基因39-40
• 3.7 HLCS的蛋白水平表達(dá)情況40-43
• 3.8 HLCS的功能學(xué)鑒定43-46
• 3.8.1 HLCs的糖原合成與貯存功能43-44
• 3.8.2 HLCs的LDL攝取能力44-45
• 3.8.3 HLCs的ICG攝取與排泄能力45-46
• 第4章 討論46-49
• 4.1 體外誘導(dǎo)靶細(xì)胞的選擇46-47
• 4.2 定行內(nèi)胚層的優(yōu)勢(shì)47
• 4.3 誘導(dǎo)方法的優(yōu)化與改良47-49
• 第5章 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-56
• 作者簡(jiǎn)介及在學(xué)期間所取得的科研成果56-57
• 致謝57

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 于俊蘭;徐迎新;李榮;;骨髓干細(xì)胞的肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化[J];醫(yī)學(xué)綜述;2005年12期

2 胡晶;牟玲;羅恩杰;;體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞樣細(xì)胞方向分化[J];微生物學(xué)雜志;2008年03期

3 趙化芳;李曉燕;史小林;;誘導(dǎo)小鼠原始生殖細(xì)胞向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化的新方法[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2009年05期

4 李偉;劉蘇南;羅端德;曾令蘭;李淑莉;;膽汁化血清對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞樣細(xì)胞定向分化的誘導(dǎo)[J];內(nèi)科理論與實(shí)踐;2007年04期

5 張濤;趙振國(guó);高輝;;大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為肝細(xì)胞樣細(xì)胞[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2011年36期

6 湯志華,閔軍,陳積圣,霍景山,胡孝渠,殷香保,陳波;體外誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞的特征及功能[J];中國(guó)臨床康復(fù);2005年19期

7 司煜安;許文榮;嚴(yán)永敏;錢(qián)暉;朱偉;周忠海;徐靜;周洪興;曹慧玲;李繼剛;;體外誘導(dǎo)人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞[J];江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2008年01期

8 邢全臺(tái);孫啟龍;李棟;邢培祥;馬瑞萍;陳豐哲;邵美英;姚永遠(yuǎn);關(guān)彥彥;;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化[J];世界華人消化雜志;2009年26期

9 陳耀凱;王宇明;李俊剛;郎松;;大鼠肝卵圓細(xì)胞的生物學(xué)特征[J];世界華人消化雜志;2003年04期

10 舒賽男;魏來(lái);展玉濤;方峰;王宇;;大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為成熟肝細(xì)胞樣細(xì)胞[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2006年09期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

1 李偉;羅端德;賀永文;;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)定向分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞的初步探討[A];第二屆全國(guó)人工肝及血液凈化學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2005年

2 賈戰(zhàn)生;魏欣;王春雨;劉秋平;李光玉;李羽;白雪帆;;胎兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及其向肝細(xì)胞樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十二次全國(guó)病毒性肝炎及肝病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2005年

3 王韞芳;南雪;岳文;白慈賢;閆舫;裴雪濤;;大鼠骨髓來(lái)源的Thy-1~+細(xì)胞向肝細(xì)胞樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究[A];第九屆全國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要匯編[C];2003年

4 李文晰;段芳齡;馬軍;;誘導(dǎo)CD117~+骨髓干細(xì)胞向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化的研究[A];第一屆全國(guó)疑難重型肝病大會(huì)、第四屆全國(guó)人工肝及血液凈化學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2008年

5 郭靜;裘云慶;;一種分離正常成年大鼠肝臟祖細(xì)胞新方法的研究[A];第三屆江浙滬中西醫(yī)結(jié)合高峰論壇論文匯編[C];2011年

6 王曉;段芳齡;馬軍;;體外誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)CD45~-HLA-DR~-細(xì)胞亞群向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化[A];第一屆全國(guó)疑難重型肝病大會(huì)、第四屆全國(guó)人工肝及血液凈化學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2008年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 王建軍;體外誘導(dǎo)生成人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞及向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化的研究[D];中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2015年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 劉小梅;毛囊源性iPS細(xì)胞經(jīng)定行內(nèi)胚層誘導(dǎo)為肝細(xì)胞樣細(xì)胞的研究[D];吉林大學(xué);2016年

2 胡晶;體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞樣細(xì)胞方向分化的初步研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2008年

3 王曉;體外誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞亞群—CD45～-HLA-DR～-細(xì)胞向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化的研究[D];鄭州大學(xué);2003年

，

本文編號(hào)：534494