本文關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)潰瘍性結(jié)腸炎的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】： 目的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)具有高度增殖、自我更新能力,可向三個(gè)胚層的細(xì)胞分化[1],在機(jī)體組織損傷修復(fù)過(guò)程及細(xì)胞移植治療等多個(gè)領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。目前已有干細(xì)胞移植成功治療炎癥性腸病的報(bào)道[2],但其在消化道分布定位情況及治療機(jī)制仍不明確。本實(shí)驗(yàn)擬①制作、比較大鼠潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)模型;②分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增、熒光標(biāo)記大鼠BMSCs,觀察其生物學(xué)特性;③觀察標(biāo)記的同種異體BMSCs經(jīng)靜脈移植后不同時(shí)間在UC及正常大鼠主要器官、消化道各段的分布情況:結(jié)腸內(nèi)BMSCs是否明顯多于消化道其余各段?潰瘍病灶處BMSCs是否明顯多于非潰瘍部位?移植BMSCs后是否結(jié)腸病變修復(fù)優(yōu)于非移植組?EGF能否促進(jìn)BMSCs向潰瘍部位遷移?為BMSCs在消化管組織工程以及腸黏膜損傷性疾病治療研究中的應(yīng)用,提供基礎(chǔ)理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型的建立與比較 1材料與方法 SD大鼠64只,隨機(jī)分為:Ⅰ組(免疫+TNBS/乙醇)和Ⅱ組(TNBS/乙醇)各24只,Ⅲ組(乙醇)12只,Ⅳ組(生理鹽水)4只。參照文獻(xiàn)制作模型,于造模后第1、21天,第8周、12周處死大鼠,剖取全部結(jié)腸及回腸末段觀察:①大體形態(tài)及結(jié)腸黏膜損傷情況;②光鏡下結(jié)腸黏膜損傷;③免疫組化檢測(cè)不同模型組腸壁組織表達(dá)TNF-α和IL-10的情況。 2結(jié)果 2.1肉眼及光鏡顯示:Ⅰ、Ⅱ組均出現(xiàn)糜爛、潰瘍等典型UC結(jié)腸病變,Ⅰ組還伴有末段回腸病變;Ⅰ組的病變可維持8周,Ⅱ組病變3周后趨向愈合。Ⅲ組病變僅黏膜充血水腫和少量糜爛或淺表潰瘍,第21天痊愈。Ⅳ組未見(jiàn)組織損傷。 2.2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果經(jīng)圖象分析顯示:成模期內(nèi)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組結(jié)腸黏膜TNF-α表達(dá)高于正常對(duì)照的Ⅳ組,IL-10低于正常對(duì)照的Ⅳ組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 第二部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性與標(biāo)記 1材料與方法 1.1取4-6周SD大鼠的股骨、脛骨骨髓,分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增獲取BMSCs。檢測(cè)BMSCs的貼壁率、生長(zhǎng)曲線;流式細(xì)胞儀檢測(cè)第3和第5代(P3和P5)BMSCs表達(dá)CD44、CD45和CD90的情況,以及細(xì)胞周期分析。 1.2 Hoechst33342 (HCT)熒光標(biāo)記P3-BMSCs后,不同時(shí)點(diǎn)熒光顯微鏡觀察計(jì)算標(biāo)記率。常規(guī)凍存復(fù)蘇BMSCs,觀察其生長(zhǎng)情況。 2結(jié)果 2.1分離、培養(yǎng)的原代細(xì)胞易于貼壁,平均活細(xì)胞率為95.6±1.4%。培養(yǎng)3~12d,細(xì)胞數(shù)量迅速增多,具有典型的長(zhǎng)梭狀的形態(tài)及漩渦狀排列的特征。傳代BMSCs的生長(zhǎng)快于原代細(xì)胞;P3～P5 BMSCs的生長(zhǎng)滯留期約為24~48h,對(duì)數(shù)增殖期約為3~6d,7~8d后進(jìn)入平臺(tái)期;在含10%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基中每傳代一次,細(xì)胞增加約2.2倍;6代后細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)異常的衰老征象。凍存的BMSCs復(fù)蘇后生長(zhǎng)較慢,復(fù)蘇傳代后可恢復(fù)至未凍存前傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。 2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)P3和P5細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44、CD90為陽(yáng)性,CD45為陰性。CD44、CD90的均一性分別為98.26±0.48%及98.68±0.32%。細(xì)胞周期檢測(cè)G0/G1期細(xì)胞約為90.81%,S+M+G2期為9.12%。 2.3 HCT熒光標(biāo)記后的BMSCs生長(zhǎng)正常,標(biāo)記率隨時(shí)間延長(zhǎng)緩慢減弱,4周后仍有約90% BMSCs可觀察到熒光。 第三部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)潰瘍性結(jié)腸炎的作用 1材料與方法 1.1 SD大鼠60只隨機(jī)分為A、B、C和D組,每組15只。A、B、C組以免疫+TNBS/乙醇復(fù)合法建立UC模型。制備HCT熒光標(biāo)記的P3～P5 BMSCs懸液備用。模型制備完成后24 h內(nèi),4組大鼠均經(jīng)尾靜脈注射1ml不同液體:A組為生理鹽水的移植對(duì)照組;B組為熒光標(biāo)記的BMSCs懸液(1×106)的移植組;C組為含300μg EGF的熒光標(biāo)記BMSCs懸液(1×106)的移植組;D組為熒光標(biāo)記的BMSCs懸液(1×106)的模型對(duì)照組。 1.2移植后第3、7、14天各處死5只,解剖觀察結(jié)腸病變。取B、C和D組的骨髓、肺、肝、脾和消化道組織行冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察熒光標(biāo)記的BMSCs在骨髓、肺、肝、脾、食道、胃、小腸和結(jié)腸內(nèi)的分布。并檢測(cè)各組各時(shí)間點(diǎn)切片隨機(jī)10個(gè)20倍物鏡視野上的熒光積分光密度(integrated optical density, IOD)值,觀察其在各器官、組織間的數(shù)量差異。 1.3取A、B、C和D組的結(jié)腸制成HE染色石蠟切片,觀察結(jié)腸組織的光鏡下的潰瘍病變。另取結(jié)腸石蠟切片經(jīng)免疫組化染色后觀察TNF-α和IL-10的表達(dá)。 2結(jié)果 2.1 HCT標(biāo)記細(xì)胞在肺、肝、脾、骨髓分布有一定時(shí)間規(guī)律性:肺、肝、脾的熒光IOD值7d3d14d,骨髓的熒光IOD 7d 14d 3d;第3、7d肺的熒光IOD值和第14d時(shí)骨髓的熒光IOD值略高于其他器官;同一器官同一時(shí)間點(diǎn)各組熒光IOD值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.2移植第3、7、14d,B、C和D組食道、胃及小腸的黏膜層均可見(jiàn)標(biāo)記的BMSCs,同一器官同一時(shí)間點(diǎn)各組熒光IOD值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.3移植第3d,各組結(jié)腸與同組食管、胃及小腸熒光IOD值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;移植第7、14d,B、C組結(jié)腸的熒光IOD值高于同組食道、胃及小腸(P 0.05);移植14d,B、C組結(jié)腸的熒光IOD值高于D組(P0.05),B和C組間結(jié)腸的熒光IOD值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.4鏡下觀察,標(biāo)記的BMSCs主要見(jiàn)于各移植組各時(shí)間點(diǎn)的結(jié)腸黏膜層,偶見(jiàn)于黏膜下層及肌層。第14d,B、C組結(jié)腸病變部位的BMSCs最多,黏膜糜爛和潰瘍壞死病灶均可見(jiàn)較多BMSCs,在潰瘍周邊黏膜層略多于非病變部位結(jié)腸黏膜。 2.5 A、B和C組結(jié)腸炎癥及潰瘍表現(xiàn)為全結(jié)腸性,可見(jiàn)黏膜充血、水腫、上皮細(xì)胞壞死脫落、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及潰瘍。D組結(jié)腸無(wú)異常。移植后第14d,B和C組大鼠結(jié)腸黏膜損傷修復(fù)程度明顯優(yōu)于A組,B和C組大鼠結(jié)腸黏膜損傷修復(fù)程度無(wú)明顯差異。 2.6移植后第3、7、14d ,A、B、C組結(jié)腸黏膜TNF-α表達(dá)高于D組,IL-10低于D組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);第14d, B、C組TNF-α表達(dá)低于A組,而IL-10高于A組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);B、C組TNF-α和IL-10表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 全文結(jié)論 1. 3種UC大鼠模型中,以免疫復(fù)合法所建模型為較理想的UC動(dòng)物模型。 2.用貼壁篩選法,成功分離得到大鼠BMSCs,流式細(xì)胞儀分析培養(yǎng)P3、P5 BMSCs具有MSCs的表面標(biāo)記特征,也具有干細(xì)胞的細(xì)胞周期特點(diǎn);傳代BMSCs的生長(zhǎng)較原代細(xì)胞快,在含10%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基中每傳代一次,細(xì)胞增加約2.2倍;凍存對(duì)BMSCs的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響;P6 BMSCs出現(xiàn)衰老征象。 3. Hoechst33342熒光標(biāo)記BMSCs是短期示蹤細(xì)胞的有效手段。 4.移植的BMSCs在體內(nèi)廣泛分布,在7d的肺14d的骨髓中含量略高于肝和脾,提示移植14d時(shí),多數(shù)干細(xì)胞仍在血循環(huán)中。 5.移植的BMSCs 3d即可遷移至結(jié)腸,多定居于黏膜層。移植后14d病變結(jié)腸BMSCs較其余消化道、以及正常結(jié)腸多,病變結(jié)腸黏膜層BMSCs較正常結(jié)腸黏膜多,提示BMSCs可向損傷組織定向遷移。 6.移植BMSCs后14d,移植組結(jié)腸黏膜損傷修復(fù)程度明顯優(yōu)于非移植組,提示BMSCs移植可修復(fù)或促進(jìn)損傷結(jié)腸組織修復(fù)。 7. BMSCs移植UC大鼠IL-10表達(dá)增高而TNF-α表達(dá)降低,表明移植的BMSCs可能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道TNF-α、IL-10等炎癥細(xì)胞因子達(dá)到免疫平衡來(lái)修復(fù)UC結(jié)腸病灶。 8. BMSCs移植組與BMSCs+EGF聯(lián)合移植組的BMSCs在消化道各段以及結(jié)腸病變部位或周邊的分布、炎癥因子的表達(dá)上均無(wú)明顯差異,提示單次注射EGF無(wú)促進(jìn)BMSC向損傷部位遷移及損傷修復(fù)的作用。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 潰瘍性結(jié)腸炎 移植 EGF
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R574.6
【目錄】：

• 符號(hào)說(shuō)明5-7
• 中文摘要7-13
• 英文摘要13-22
• 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)潰瘍性結(jié)腸炎的實(shí)驗(yàn)研究22-52
• 前言22-24
• 第一部分 潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型的建立與比較24-31
• 1 材料與方法24-27
• 2 結(jié)果27-28
• 3 討論28-30
• 4 小結(jié)30-31
• 第二部分 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性與標(biāo)記31-44
• 第一節(jié) BMSCs 的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增及生物學(xué)特性31-39
• 1 材料與方法31-35
• 2 結(jié)果35-37
• 3 討論37-39
• 4 小結(jié)39
• 第二節(jié) Hoechst33342 標(biāo)記BMSCs 及BMSCs 的凍存39-44
• 1 材料與方法39-41
• 2 結(jié)果41-42
• 3 討論42-43
• 4 小結(jié)43-44
• 第三部分 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)潰瘍性結(jié)腸炎的作用44-52
• 1 材料與方法44-46
• 2 結(jié)果46-49
• 3 討論49-51
• 4 小結(jié)51-52
• 全文結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-58
• 圖片58-63
• 文獻(xiàn)綜述：潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型研究現(xiàn)況63-70
• 致謝70-71
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果及發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄71

【引證文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 陳文華;黃國(guó)棟;方承康;;潰瘍性結(jié)腸炎現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展[J];中國(guó)醫(yī)藥科學(xué);2011年07期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 蔡林宏;腸愈寧對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠S100、CD83、Foxp3及STAT6影響的研究[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2013年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 陳文華;姜黃水醇提取液對(duì)冰乙酸損傷性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸粘膜保護(hù)作用及機(jī)制研究[D];南昌大學(xué);2011年

2 惠俊國(guó);四六痛瀉湯口服治療潰瘍性結(jié)腸炎的臨床療效觀察[D];山東中醫(yī)藥大學(xué);2012年

3 呂飛;復(fù)方甘草酸苷對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型炎癥影響的研究[D];湖北中醫(yī)藥大學(xué);2013年

4 孫彬彬;潰愈散保留灌腸治療氣滯血瘀型潰瘍性結(jié)腸炎的臨床觀察與研究[D];青島大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)潰瘍性結(jié)腸炎的實(shí)驗(yàn)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：457359