本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄因子Pitx2和Twist1與誘導(dǎo)型肝干細(xì)胞干性維持相關(guān)性的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：原位肝臟移植是目前治療終末期肝病唯一有效的手段，而供體肝臟的匱乏和免疫排斥反應(yīng)限制了該治療方法在臨床上的廣泛應(yīng)用。近年來，肝細(xì)胞移植作為原位肝臟移植的替代治療方案在臨床上取得了一定的治療效果。然而，用于細(xì)胞移植的供體肝細(xì)胞也存在著自身的局限性，如同樣受制于供體的缺乏，成熟肝細(xì)胞在體外存活期短，難以大量擴(kuò)增，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)肝細(xì)胞的功能逐漸降低，以及在慢性損傷的受體肝臟（如肝硬化）內(nèi)，外源成熟肝細(xì)胞的增殖受到抑制等。因此，尋找合適的、新的供體細(xì)胞來源是肝細(xì)胞移植研究的重要任務(wù)之一。 肝干細(xì)胞具有自我更新能力，并可分化為成熟的肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞。誘導(dǎo)型肝干細(xì)胞（induced hepatic stem cell，iHepSC）是本實(shí)驗(yàn)室通過譜系重編程的方法將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化而獲得的具有肝干/前體細(xì)胞特性的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)證明，iHepSC在體外培養(yǎng)過程中保持了較強(qiáng)的增殖能力和正常的核型，在體內(nèi)和體外能夠被誘導(dǎo)分化為成熟的肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞，并可再殖損傷的肝臟，而且不具有形成腫瘤的能力。因此，采用譜系重編程技術(shù)所產(chǎn)生的誘導(dǎo)型肝干細(xì)胞為臨床上肝臟疾病的細(xì)胞治療提供了一個(gè)新的供體細(xì)胞來源。然而，目前對(duì)這種誘導(dǎo)型肝干細(xì)胞的干性維持機(jī)制尚缺乏認(rèn)識(shí)，而這是iHepSC進(jìn)入臨床應(yīng)用需要解決的問題之一。 為了認(rèn)識(shí)肝干細(xì)胞干性維持的調(diào)控機(jī)制，本課題通過單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)比較了肝干細(xì)胞和分化細(xì)胞之間的基因表達(dá)差異，并重點(diǎn)比較了轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平，獲得了五個(gè)表達(dá)差異最為顯著的轉(zhuǎn)錄因子：Pitx2、Twist1、Stat3β、TSC22d1和GATA6。在此基礎(chǔ)上，本課題重點(diǎn)研究了Pitx2（Paired-likehomeodomain transcription factor2，配對(duì)樣同源轉(zhuǎn)錄因子2）和Twist1（The BasicHelix-loop-helix (bHLH) transcription factors，堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子）在iHepSC中對(duì)肝干細(xì)胞干性維持的作用。在本研究中，利用shRNA慢病毒干擾的載體獲得了Pitx2和Twist1基因穩(wěn)定沉默的iHepSC-Sh-Pitx2和iHepSC-Sh-Twist1細(xì)胞株。 通過比較基因沉默前后誘導(dǎo)型肝干細(xì)胞的干性相關(guān)的基因、自我更新能力和分化潛能，系統(tǒng)地分析了轉(zhuǎn)錄因子Pitx2和Twist1在誘導(dǎo)型肝干細(xì)胞中對(duì)干性維持的作用。 當(dāng)Pitx2和Twist1基因分別沉默后，iHepSC-Sh-Pitx2和iHepSC-Sh-Twist1細(xì)胞在形態(tài)上未見明顯改變。接下來本研究應(yīng)用RT-PCR對(duì)iHepSC-Sh-Pitx2和iHepSC-Sh-Twist1細(xì)胞中肝干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，肝干細(xì)胞的基本標(biāo)志物，如肝細(xì)胞的分子標(biāo)志白蛋白（Albumin，Alb）、膽管細(xì)胞的分子標(biāo)志細(xì)胞角蛋白19（Cytokeratin-19，CK19）和未成熟肝細(xì)胞的分子標(biāo)志甲胎蛋白（α-Fetoprotein，Afp）在iHepSC-Sh-Pitx2和iHepSC-Sh-Twist1細(xì)胞中的表達(dá)均有一定程度的降低。肝干細(xì)胞的另兩個(gè)重要分子標(biāo)志Lgr5和EpCAM在iHepSC-Sh-Pitx2和iHepSC-Sh-Twist1細(xì)胞中的表達(dá)明顯減弱，而iHepSC中高表達(dá)的肝干細(xì)胞重要分子標(biāo)志Sox9在iHepSC-Sh-Pitx2和iHepSC-Sh-Twist1細(xì)胞中沒有表達(dá)，進(jìn)一步的免疫細(xì)胞化學(xué)分析從蛋白表達(dá)水平也證明了Lgr5、EpCAM和Sox9的表達(dá)變化。肝干細(xì)胞干性相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的變化提示我們，分別沉默轉(zhuǎn)錄因子Pitx2和Twist1后，對(duì)iHepSC的干性維持產(chǎn)生了一定程度的影響。 肝干細(xì)胞的基本特征首先是具備一定的自我更新能力。對(duì)iHepSC與iHepSC-Sh-Pitx2和iHepSC-Sh-Twist1細(xì)胞的增殖特性進(jìn)行比較，HepSC-Sh-Pitx2和iHepSC-Sh-Twist1細(xì)胞的克隆形成能力顯著降低，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)CCK8結(jié)果顯示，iHepSC-Sh-Pitx2和iHepSC-Sh-Twist1細(xì)胞在24小時(shí)和48小時(shí)的增殖速度明顯低于iHepSC，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Brdu和Ki67等細(xì)胞增殖指標(biāo)也同樣顯示，，iHepSC-Sh-Pitx2和iHepSC-Sh-Twist1細(xì)胞在24小時(shí)和48小時(shí)的Brdu、Ki67陽性細(xì)胞的數(shù)目顯著少于iHepSC。這些結(jié)果說明Pitx2和Twist1能夠顯著降低iHepSC的增殖能力，即自我更新能力。 肝干細(xì)胞的另一基本特征是具有肝向和膽向分化的潛能。我們對(duì)Pitx2和Twist1分別沉默后，iHepSC是否發(fā)生自發(fā)分化進(jìn)行了初步分析。通過檢測(cè)肝向分化分子標(biāo)志αAT、TAT和TTR，膽向分化標(biāo)志NCAM、CK7和ChromA，成熟肝細(xì)胞分子標(biāo)志G6P、Cyp7a1和Cyp3a11。結(jié)果顯示：Pitx2和Twist1表達(dá)沉默后，iHepSC沒有向任一方向分化的趨勢(shì)。說明在未改變細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境和不處于特定的誘導(dǎo)分化條件下，Pitx2和Twist1可能不是促進(jìn)iHepSC雙向分化的主要原因，Pitx2和Twist1對(duì)誘導(dǎo)型肝干細(xì)胞分化功能的影響還需要更進(jìn)一步的研究。 由于MEFs在向iHepSC轉(zhuǎn)分化的過程中發(fā)生了間質(zhì)向上皮的轉(zhuǎn)變（mesenchymal-epithelial transition, MET）。因此，本研究檢測(cè)了Pitx2和Twist1轉(zhuǎn)錄因子分別沉默后的iHepSC-Sh-Pitx2和iHepSC-Sh-Twist1細(xì)胞上皮間質(zhì)分子標(biāo)志的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：iHepSC-Sh-Pitx2和iHepSC-Sh-Twist1細(xì)胞的上皮分子標(biāo)志Claudin、N-Cadherin、E-Cadherin和β-Catenin的表達(dá)減弱，而間質(zhì)分子標(biāo)志Snail、Slug和Vimentin的表達(dá)明顯增強(qiáng)。說明Pitx2和Twist1沉默后iHepSC具有向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)。 本課題首次對(duì)轉(zhuǎn)錄因子Pitx2和Twist1對(duì)誘導(dǎo)型肝干細(xì)胞干性維持的作用進(jìn)行了研究。iHepSC在轉(zhuǎn)錄因子Pitx2和Twist1分別沉默后，其自我更新的能力下降，肝干細(xì)胞干性分子標(biāo)志表達(dá)減弱或消失，且iHepSC具有向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)。這些結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄因子Pitx2和Twist1對(duì)誘導(dǎo)型肝干細(xì)胞干性維持起著重要的作用，但其對(duì)iHepSC分化作用的影響還需要更加深入的研究。本研究所建立的iHepSC-Sh-Pitx2和iHepSC-Sh-Twist1基因穩(wěn)定沉默的細(xì)胞株，可以作為肝干細(xì)胞干性維持研究的細(xì)胞模型，同時(shí)該研究也為肝干細(xì)胞干性維持的調(diào)控機(jī)制和肝臟疾病的細(xì)胞治療研究提供了新的線索。
【關(guān)鍵詞】：Pitx2 Twist1 肝干細(xì)胞 干性維持
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R575
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 縮略詞表11-12
• 前言12-15
• 實(shí)驗(yàn)材料15-23
• 實(shí)驗(yàn)方法23-33
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-47
• 討論47-51
• 參考文獻(xiàn)51-55
• 附錄55-58
• 綜述58-69
• 參考文獻(xiàn)65-69
• 致謝69

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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本文編號(hào)：453806