本文關(guān)鍵詞：臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞在肝纖維化及肝硬化大鼠體內(nèi)的肝細(xì)胞樣分化作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肝纖維化（hepatic fibrosis, HF）是肝臟對各種不同致病因子引起的慢性炎癥、壞死或其他損傷的修復(fù)反應(yīng)，肝硬化則是肝纖維化的終末階段。此時，肝炎病毒、酒精代謝產(chǎn)物、膽汁酸等肝臟毒性物質(zhì)作用于肝細(xì)胞，肝功能明顯下降，同時受損肝細(xì)胞釋放的AST、ALT、TBIL、DBIL、活性氧（reactive oxygen species, ROS）和纖維形成介質(zhì)導(dǎo)致自身凋亡。目前肝移植是治療終末期肝病的唯一有效方法，但由于肝源緊張、免疫排斥等原因限制了肝移植的臨床應(yīng)用。因此亟待尋找新的有效治療方法。 細(xì)胞治療是指有活性的細(xì)胞替代、修復(fù)損傷的組織，進(jìn)而使組織器官恢復(fù)其功能的有效治療方法。近年來細(xì)胞治療已成為替代器官移植的有效治療方法。其中干細(xì)胞治療肝硬化等終末期肝病的療效已得到證實。 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一種來源于中胚層的具有多向分化潛能的干細(xì)胞，廣泛存在于骨髓、臍帶組織、臍血、外周血及脂肪等組織中，在特定條件下，可以分化為骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞等多種細(xì)胞。MSCs易于提取，低免疫原性，并且具有免疫抑制作用，避免了肝移植的肝源緊張、移植后免疫排斥等不足，被認(rèn)為是目前最具治療潛力的供體細(xì)胞。有研究證實骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrowmesenchymal stem cells, BM-MSCs)可以分化為功能性肝細(xì)胞，修復(fù)損傷的肝組織，從而改善肝纖維化和肝硬化；另有研究發(fā)現(xiàn)脂肪源MSCs(adiposetissue-derived mesenchymal stem cells, AT-MSCs)在體外向肝細(xì)胞分化過程中經(jīng)歷了間充質(zhì)細(xì)胞向上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)變(mesenchymal-to-epithelialtransition, MET)。關(guān)于MSCs在體內(nèi)的動態(tài)分化過程及在此分化過程中是否經(jīng)歷了MET尚不清楚。為此，我們構(gòu)建大鼠肝纖維化及肝硬化模型，經(jīng)尾靜脈注射人臍帶源MSCs (human umbilical cord-derived mesenchymalstem cells, hUC-MSCs)，觀察hUC-MSCs對肝纖維化、肝硬化的治療作用，在體內(nèi)的動態(tài)分化過程及分化的具體機制，為hUC-MSCs治療肝纖維化及肝硬化提供理論依據(jù)。 目的：研究hUC-MSCs在肝纖維化及肝硬化大鼠體內(nèi)的動態(tài)分化過程及其分化機制。 方法：將健康成年雄性Wistar大鼠分為對照組（正常大鼠，CCl_4/saline0wk，8只），模型組(肝纖維化模型組：CCl_4/saline4wks，5wks，7wks；肝硬化模型組：CCl_4/saline8wks，10wks，14wks；每組8只)，MSCs移植組(肝纖維化MSCs移植組：CCl_4/MSCs0wk，1wk，2wks，4wks；肝硬化MSCs移植組；CCl_4/MSCs0wk，2wks，4wks，8wks；每組8只)。采用濃度40%CCl_4橄欖油溶液，按2ml/kg體重的劑量，給予四肢輪流皮下注射，每周2次；造模成功后模型組及治療組繼續(xù)每周2次皮下注射CCl_4，直至處死。肝纖維化及肝硬化MSCs移植組分別于造模成功后（即CCl_4注射第4周和第7周）經(jīng)尾靜脈注射hUC-MSCs，劑量為5×106個/只，并分別于注射后1、2、4周和2、4、8周處死大鼠。 應(yīng)用血清學(xué)檢測方法檢測大鼠ALT、AST、ALB、TBIL、DBIL，觀察hUC-MSCs移植對大鼠肝功能的影響；采用Haematoxylin and eosinstaining(HE染色)、Masson’s trichrome staining(MT染色)和天狼猩紅染色法檢測肝組織病理改變；采用免疫熒光染色、Western blot和real-timeQ-PCR方法檢測各組大鼠肝臟組織中人來源的ALB、AFP蛋白和mRNA的表達(dá)，免疫組織化學(xué)染色、Western blot和Real time-PCR方法檢測人來源的CK18、CK19、vimentin、α-catenin、E-cadherin蛋白和mRNA在大鼠肝組織中的表達(dá)，采用Real time-PCR方法檢測人來源的N-cadherin。 結(jié)果：①HE、MT及天狼猩紅染色結(jié)果顯示：CCl_4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化和肝硬化模型成功建立，模型組隨給藥時間的延長，肝細(xì)胞變性壞死及肝內(nèi)纖維組織沉積逐漸增多；與模型組相比，MSCs移植組肝細(xì)胞變性壞死有所減少，HE炎癥評分、纖維化程度分級及纖維組織沉積定量分析結(jié)果顯示：與模型組相比，除肝纖維化MSCs移植CCl_4/MSCs1wk組與肝纖維化模型CCl_4/saline4wks組相比無明顯差異外，肝纖維化CCl_4/MSCs2wks組、4wks組及肝硬化MSCs移植各組均顯示存在顯著性差異；②血清學(xué)檢測結(jié)果顯示：在肝纖維化MSCs移植組模型中，CCl_4/MSCs1wk組肝功能較CCl_4/saline4wks組無明顯改善，在CCl_4/MSCs2wks組中，ALT、AST較CCl_4/saline5wks組中的顯著降低，ALB、TBIL、DBIL無明顯改善；在肝硬化MSCs移植組模型中，CCl_4/MSCs2wks中的ALB較CCl_4/saline8wks組無明顯升高，其余各個時間點MSCs移植組較模型組的肝功能明顯好轉(zhuǎn)。③免疫熒光染色及免疫組織化學(xué)染色檢測結(jié)果顯示：肝纖維化MSCs移植組中，ALB、AFP、CK18、CK19、E-cadherin及α-catenin表達(dá)水平隨移植時間的延長表達(dá)量逐漸升高，vimentin表達(dá)量隨MSCs移植時間的延長其含量逐漸下降；在肝硬化MSCs移植組中，隨MSCs移植時間的延長，ALB、CK18表達(dá)量逐漸增多，vimentin隨移植時間的延長其含量逐漸下降，AFP、CK19、E-cadherin及α-catenin在移植后4周較2周組有所增加，移植后8周組較4周組下降，在MSCs移植前以上蛋白均無表達(dá)。④應(yīng)用Western blot檢測ALB、AFP、CK18、CK19在大鼠肝臟組織中的表達(dá)，在肝纖維化MSCs移植組，CCl_4/MSCs2wks組的ALB、CK18的蛋白表達(dá)水平與CCl_4/MSCs1wk組的無顯著性差異，而CCl_4/MSCs4wks組的ALB、CK18的蛋白表達(dá)較CCl_4/MSCs2wks組的顯著升高，隨MSCs移植時間的延長，AFP、CK19的蛋白表達(dá)水平逐漸升高，以上4種蛋白在MSCs移植前均呈陰性表達(dá)；在肝硬化MSCs移植組中，與CCl_4/MSCs2wks組相比，CCl_4/MSCs4wks組的AFP、CK19mRNA表達(dá)顯著升高，而CCl_4/MSCs8wks組的AFP、CK19mRNA較CCl_4/MSCs4wks組顯著下降，CK18、ALB的蛋白隨MSCs移植時間的延長而表達(dá)增加，其上蛋白在MSCs移植前均為陰性表達(dá)。⑤應(yīng)用real-time Q-PCR檢測結(jié)果顯示：在肝纖維化MSCs移植組中，CCl_4/MSCs2wks組的ALB、CK18mRNA表達(dá)水平與CCl_4/MSCs1wk組中的無顯著性差異；而CCl_4/MSCs4wks組的ALB、CK18mRNA含量較CCl_4/MSCs2wks組的顯著升高，，隨MSCs移植時間的延長，AFP、CK19的mRNA表達(dá)水平顯著升高；在肝硬化MSCs移植組中，與CCl_4/MSCs2wks組相比，CCl_4/MSCs4wks組的AFP、CK19mRNA表達(dá)顯著升高，而CCl_4/MSCs8wks組中的AFP、CK19mRNA表達(dá)含量較CCl_4/MSCs4wks組的顯著下降，CK18、ALB mRNA水平隨移植時間的延長而表達(dá)顯著增加，以上幾個指標(biāo)的mRNA在MSCs移植前均無表達(dá)。⑥Western blot檢測結(jié)果顯示，在肝纖維化MSCs移植組中，vimentin蛋白隨MSCs移植時間的延長而表達(dá)下降，隨MSCs移植時間的延長，E-cadherin及α-catenin的蛋白表達(dá)水平顯著增加，以上蛋白在MSCs移植前均為陰性表達(dá)；在肝硬化MSCs移植組中，與CCl_4/MSCs2wks組相比，CCl_4/MSCs4wks組的E-cadherin、α-catenin mRNA表達(dá)顯著升高，而CCl_4/MSCs8wks組的E-cadherin、α-catenin mRNA較CCl_4/MSCs4wks組顯著下降，隨MSCs移植時間的延長，N-cadherin、vimentin mRNA表達(dá)水平顯著下降，以上蛋白在MSCs移植前均無表達(dá)。⑦應(yīng)用real-time Q-PCR檢測結(jié)果顯示：在肝纖維化MSCs移植組中，N-cadherin、vimentin mRNA隨MSCs移植時間的延長而表達(dá)下降；隨MSCs移植時間的延長，E-cadherin及α-catenin mRNA的表達(dá)顯著增加；在肝硬化MSCs移植組，與CCl_4/MSCs2wks組相比，CCl_4/MSCs4wks組的E-cadherin、α-catenin mRNA表達(dá)顯著升高，而CCl_4/MSCs8wks組的E-cadherin、α-catenin mRNA較CCl_4/MSCs4wks組的顯著下降，隨MSCs移植時間的延長，N-cadherin、vimentin mRNA表達(dá)水平顯著下降，N-cadherin、vimentin、E-cadherin及α-catenin在MSCs移植前均無表達(dá)。 結(jié)論：hUC-MSCs移植對大鼠肝纖維化及肝硬化均具有治療作用，hUC-MSCs分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞是其治療機制之一；hUC-MSCs在體內(nèi)向肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)化是一個動態(tài)分化的過程，在此分化過程中hUC-MSCs經(jīng)歷了MET。
【關(guān)鍵詞】：肝纖維化 肝硬化 hUC-MSCs 肝細(xì)胞 分化
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R575.2
【目錄】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-13
• 前言13-15
• 材料與方法15-32
• 結(jié)果32-40
• 附圖40-58
• 附表58-59
• 討論59-63
• 結(jié)論63-64
• 參考文獻(xiàn)64-67
• 綜述 MSCs 分化為功能性肝細(xì)胞的研究進(jìn)展67-79
• 參考文獻(xiàn)73-79
• 致謝79-80
• 個人簡歷80

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 胡維亨;任軍;;人乙型肝炎病毒DNA陽性血清對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的影響[J];北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2008年05期

2 王宇明;湯影子;;重型乙型肝炎發(fā)病機制研究進(jìn)展[J];傳染病信息;2008年02期

3 吳雄志;趙連三;許倩;張怡;唐紅;;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在肝部分切除模型小鼠體內(nèi)向肝細(xì)胞分化[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2005年06期

4 閆俊卿;韓濤;朱爭艷;;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及向類肝細(xì)胞的分化[J];世界華人消化雜志;2008年15期

5 何文艷;劉樹賢;姜慧卿;;大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向類肝細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化[J];世界華人消化雜志;2008年22期

6 邢全臺;孫啟龍;李棟;邢培祥;馬瑞萍;陳豐哲;邵美英;姚永遠(yuǎn);關(guān)彥彥;;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化[J];世界華人消化雜志;2009年26期

7 呂璐璐;宋永平;魏旭東;房伯俊;張艷莉;李玉富;;人臍帶和骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特征的對比研究[J];中國實驗血液學(xué)雜志;2008年01期

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本文編號：396528