本文關(guān)鍵詞：DNA甲基化在大鼠肝纖維化中的作用及其部分機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肝纖維化是慢性肝臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中的共有病理反應(yīng)，活化的肝星狀細(xì)胞分泌ECM增多是其發(fā)病的主要特征，因此肝星狀細(xì)胞（HSC）活化被認(rèn)為是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，抑制HSC活化是抗肝纖維化治療關(guān)鍵步驟。研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化在HSC活化過程中具有重要作用。為了進(jìn)一步探討DNA甲基化在肝纖維化中的作用機(jī)制，通過在體與離體兩個方面觀察DNA甲基化相關(guān)蛋白在肝組織與細(xì)胞中的變化，及其對HSC活化的影響，并探討其部分作用機(jī)制。研究內(nèi)容主要包括以下四個部分： 1. PTEN在CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝組織中的表達(dá)及甲基化的狀態(tài) CCl4皮下注射建立大鼠肝纖維化模型，正常組10只、模型組20只。自處理之日開始，模型組大鼠皮下注射50%CCl4植物油溶液(1ml/kg)每周2次，共12周；正常組給予同樣劑量花生油皮下注射，在12周末，取肝組織進(jìn)行病理組織學(xué)和Masson膠原染色檢測，并檢測PTEN、α-SMA在大鼠肝組織中的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在肝纖維化形成過程中PTEN表達(dá)降低。利用甲基化特異性PCR（MSP-PCR）檢測PTEN甲基化的狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)在CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝組織中PTEN發(fā)生了高甲基化。 2. DNA甲基化抑制劑使PTEN發(fā)生去甲基化及恢復(fù)了PTEN的表達(dá)，從而抑制HSC的活化 以大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6為研究對象，，利用TGF-β15ng/ml刺激30m后，加入不同濃度的5-AzadC溫育48h，RT-PCR方法檢測PTEN，α-SMA，Collagen I的mRNA表達(dá)變化；免疫印跡觀察PTEN，α-SMA蛋白的表達(dá)。利用甲基化特異性PCR（MSP-PCR）檢測PTEN甲基化的狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在體外TGF-β1誘導(dǎo)HSC-T6中PTEN高甲基化，5-AzadC能使高甲基化的PTEN去甲基化進(jìn)而恢復(fù)PTEN表達(dá)，并可抑制HSC-T6的活化。 3. DNMT1調(diào)控PTEN表達(dá)及其對甲基化的作用研究 根據(jù)DNMT1的堿基序列設(shè)計(jì)并合成小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)，通過脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染到HSC-T6細(xì)胞內(nèi)，熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測HSC-T6的細(xì)胞增殖變化；RT-PCR檢測DNMT1、α-SMA、Collagen I mRNA的表達(dá)；免疫組化，免疫熒光及Western Blot檢測DNMT1、α-SMA蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靶向沉默DNMT1可明顯降低TGF-β1刺激的HSC-T6中α-SMA、Collagen I基因的表達(dá)水平；MSP-PCR檢測顯示，靶向封閉DNMT1基因的表達(dá)可使PTEN去甲化，進(jìn)而抑制HSC-T6細(xì)胞的活化增殖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DNMT1通過介導(dǎo)PTEN甲基化來促進(jìn)HSC-T6活化。 4. DNA甲基化抑制劑和DNMT1沉默對PTEN下游信號通路的影響Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，CCl4誘導(dǎo)的肝組織和體外TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化中p-ERK，p-AKT的表達(dá)水平，DNA甲基化抑制劑和DNMT1沉默可抑制p-ERK，p-AKT表達(dá)水平。表明PTEN高甲基化激活了下游信號通路進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化的形成。
【關(guān)鍵詞】：肝纖維化 肝星狀細(xì)胞 人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因 DNA甲基化 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R575.2;R96
【目錄】：

• 縮略詞表5-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-13
• 實(shí)驗(yàn)材料13-17
• 實(shí)驗(yàn)方法17-34
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-53
• 討論53-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-63
• 附錄63-65
• 致謝65-66
• 綜述66-93
• References82-93

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：386513