發(fā)布時(shí)間：2017-05-18 02:08

  本文關(guān)鍵詞：HCN1在胃腸道分布特點(diǎn)及萊菔苷對(duì)其作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景： 胃腸動(dòng)力障礙疾病是臨床常見疾病，困擾人類健康，不同程度上降低患者的生活質(zhì)量，給病人、家庭及社會(huì)造成了巨大的心理及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。胃腸動(dòng)力障礙疾病一直被認(rèn)為是由于胃腸道平滑肌的運(yùn)動(dòng)發(fā)生異常，尤其是起搏功能異常導(dǎo)致。近年來，cajal間質(zhì)細(xì)胞（Interstitial cells of Cajal, ICC）成為胃腸起搏的研究熱點(diǎn)，被認(rèn)為在胃腸道起搏過程中起重要作用。有研究表明，在哺乳動(dòng)物中超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道（Hyperpolarization-activated cyclicNucleotide-gated channels, HCN）為具有慢波起搏特性的離子通道，其在心臟起搏以及神經(jīng)電活動(dòng)方面的作用已非常明確，該通道有4個(gè)亞型，各亞型間雖功能上存在一定差異，但均具有以下特點(diǎn)：超極化激活；鈉、鉀、鈣離子混合通透；直接受環(huán)磷酸腺苷（Cyclic Adenosine monophosphate,cAMP）調(diào)控。目前研究證實(shí)，該通道不僅與神經(jīng)系統(tǒng)疾病聯(lián)系緊密，與胃腸道動(dòng)力障礙疾病也存在一定聯(lián)系。而對(duì)于HCN1亞型，本實(shí)驗(yàn)室前期預(yù)實(shí)驗(yàn)通過超微結(jié)構(gòu)觀察、免疫熒光雙標(biāo)、蛋白胚胎發(fā)育情況觀察到HCN1在ICC上的特異分布，進(jìn)一步離體實(shí)驗(yàn)通過給以HCN1特異性阻斷劑ZD7288觀察離體肌條的收縮變化，證明HCN1不但特異分布于ICC并可能是胃腸道起搏的始發(fā)離子通道，為探討胃腸動(dòng)力起搏的機(jī)制研究提出了新的理論。就目前臨床上促胃腸動(dòng)力藥物的應(yīng)用與開發(fā)方面來看依然是十分有限，尤其是無明顯毒副作用的中藥的開發(fā)尚需亟待解決。前期我們研究發(fā)現(xiàn)，白蘿卜子即萊菔子具有顯著促胃腸動(dòng)力的功能，但其促胃腸功能的機(jī)制及可能靶點(diǎn)尚不明確。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究萊菔粗提物的提純物萊菔苷（Raphanusin）對(duì)胃腸道的作用機(jī)制對(duì)開發(fā)具有祖國(guó)醫(yī)學(xué)傳統(tǒng)特色的促胃腸動(dòng)力新藥有重要意義。 目的： 本研究擬利用免疫熒光雙標(biāo)記觀察HCN1在大鼠胃腸各部分的分布特點(diǎn)以及胃腸道各部分的電生理特點(diǎn)，通過對(duì)大鼠灌胃進(jìn)一步觀察萊菔子提純物萊菔苷對(duì)胃腸各部分電生理的影響，以及給予HCN1通道阻斷劑ZD7288干擾后萊菔苷對(duì)胃腸電活動(dòng)的影響情況。并進(jìn)一步進(jìn)行離體ICC原代培養(yǎng)，觀察HCN1在離體ICC上的分布情況，并對(duì)離體ICC進(jìn)行加藥處理，對(duì)比萊菔苷與傳統(tǒng)促胃腸動(dòng)力藥物胃復(fù)安對(duì)離體ICC的影響，從而探索萊菔苷對(duì)胃腸起搏通道HCN1的作用情況，為研究新的胃腸動(dòng)力機(jī)制提供理論依據(jù)。 方法： 1．采用免疫熒光法，觀察離子通道HCN1在胃腸道分布的特點(diǎn)，并采用電生理的方法，測(cè)定胃腸道不同部位胃腸運(yùn)動(dòng)的狀況。 2．給予萊菔苷灌胃后，觀察給藥前后胃腸道不同部位的電活動(dòng)的變化；再采用尾靜脈注射HCN1特異性阻斷劑ZD7288予以干預(yù)，觀察予以同劑量萊菔苷灌胃后，胃腸道不同部位電活動(dòng)給藥前后變化情況，并以等量生理鹽水灌胃作為對(duì)照進(jìn)行觀察。 3．采用酶消化法對(duì)新生大鼠胃腸道cajal間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)并鑒定。 4．將培養(yǎng)至2周的離體ICC進(jìn)行加藥處理，分別加入萊菔苷，胃復(fù)安，DMEM低糖培養(yǎng)液和生理鹽水，比較萊菔苷與傳統(tǒng)胃藥胃復(fù)安對(duì)胃腸動(dòng)力作用與影響。 結(jié)果： 1．HCN1在胃腸道的分布特點(diǎn)及電生理特點(diǎn) 采用免疫熒光雙標(biāo)記技術(shù)的方法，對(duì)大鼠胃腸進(jìn)行HCN1與c-kit雙重標(biāo)記染色。結(jié)果顯示：在胃、十二指腸、空腸及回腸部可見HCN1熒光標(biāo)記，以胃底-體交界處分布最為密集，后依次為十二指腸、空腸、回腸。電生理結(jié)果顯示：胃底-體交界處電活動(dòng)頻率比十二指腸處相比較慢，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）；空腸與回腸處MMC的各項(xiàng)指標(biāo)相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。 2．萊菔苷對(duì)大鼠胃腸道動(dòng)力的影響及其可能的作用靶點(diǎn) 采用灌胃的方法，給予大鼠1ml/kg濃度的萊菔苷觀察到：胃、十二指腸處電活動(dòng)波幅及頻率與給藥前相比明顯增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）；空腸及回腸MMC與給藥前相比周期明顯縮短、活動(dòng)期/周期、每分鐘快波數(shù)明顯增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。再采用靜脈注射給藥方式給予HCN1特異性阻斷劑ZD7288（0.5mmol/l）予以干預(yù)后再給予與前相同濃度的萊菔苷灌胃后觀察到：胃、十二指腸處電活動(dòng)波幅及頻率與本組給藥前、以及萊菔苷組給藥后相比明顯減弱，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）；空腸及回腸MMC與本組給藥前、萊菔苷組給藥后相比周期明顯延長(zhǎng)、活動(dòng)期/周期、每分鐘快波數(shù)明顯減少，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。生理鹽水組，給藥前后無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。 3．ICC的鑒定及HCN1的表達(dá) 采用酶消化法，對(duì)新生SD大鼠的十二指腸和空腸段進(jìn)行原代培養(yǎng)，接種于置有事先用多聚賴氨酸（0.1mg/ml）包被的24孔培養(yǎng)板內(nèi)，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天觀察一次，并拍照，細(xì)胞培養(yǎng)至第7天進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)，細(xì)胞呈c-kit抗體陽性。 4．萊菔苷對(duì)離體ICC的作用研究 對(duì)培養(yǎng)至2周時(shí)的離體ICC在24孔板里加藥，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照，分成萊菔苷組、胃復(fù)安組，培養(yǎng)液組，生理鹽水組四組，萊菔苷組與胃復(fù)安組分為1mg/ml、0.5mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml5個(gè)濃度梯度每孔500ul對(duì)照觀察30min，培養(yǎng)液組與生理鹽水組各給予等體積培養(yǎng)液、生理鹽水對(duì)照。萊菔苷組中0.5mg/ml、0.2mg/ml兩個(gè)濃度觀察半小時(shí)可見細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞胞體緊縮，突起變細(xì)；胃復(fù)安組中1mg/ml、0.5mg/ml、0.2mg/ml濃度中有類似改變，培養(yǎng)液組與生理鹽水組無明顯改變。 結(jié)論： 1．HCN1特異分布于胃腸道ICC細(xì)胞上，，且其分布密度呈現(xiàn)不均勻分布； 2．萊菔提取物—萊菔苷有明顯的促胃腸道動(dòng)力作用，且其作用的靶點(diǎn)可能是離子通道—HCN1； 3．萊菔苷通過ICC上的HCN1發(fā)揮促胃腸動(dòng)力作用且其對(duì)ICC的形態(tài)改變作用傳統(tǒng)胃動(dòng)力藥胃復(fù)安的作用效果相近。
【關(guān)鍵詞】：HCN1 ICC 起搏機(jī)制 胃腸道 萊菔苷
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R57
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-10
• Abstract10-15
• 前言15-17
• 文獻(xiàn)回顧17-29
• 第一部分 HCN1 在胃腸道的分布特點(diǎn)及胃腸電生理活動(dòng)特征29-35
• 1 材料29-30
• 2 方法30-31
• 3 結(jié)果31-34
• 4 討論34-35
• 第二部分 萊菔苷對(duì)胃腸道動(dòng)力的作用及其靶點(diǎn)35-42
• 1 材料35-36
• 2 方法36
• 3 結(jié)果36-41
• 4 討論41-42
• 第三部分 ICC 的體外培養(yǎng)鑒定及 HCN1 表達(dá)42-46
• 1 材料42
• 2 方法42-43
• 3 結(jié)果43-45
• 4 討論45-46
• 第四部分 萊菔苷對(duì)離體 ICC 作用及其作用靶點(diǎn)46-52
• 1 材料46
• 2 方法46-47
• 3 結(jié)果47-50
• 4 討論50-52
• 小結(jié)52-53
• 參考文獻(xiàn)53-60
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果60-61
• 致謝61

  本文關(guān)鍵詞：HCN1在胃腸道分布特點(diǎn)及萊菔苷對(duì)其作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：374926