本文關(guān)鍵詞：丙型肝炎病毒NS5A蛋白核酸適體抗病毒作用機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：全球大約有1.7億人感染丙型肝炎病毒(HCV),其中80%感染者將轉(zhuǎn)變成為慢性感染。HCV感染可導致慢性肝炎、肝硬化、甚至肝癌。目前對HCV感染尚無有效疫苗，并且臨床上聚乙二醇化α-干擾素(pegylated interferon alpha，PEG-IFNα)和利巴韋林(ribavirin，RBV)聯(lián)合使用的標準HCV治療方案治療周期較長，患者不良反應較嚴重。所以，有必要開發(fā)安全、有效且對HCV感染耐受良好的治療藥物。 NS5A蛋白在HCV生活周期中參與病毒RNA的復制和病毒顆粒的形成。由此可見，以NS5A蛋白作為抗HCV新型藥物的靶點，存在巨大潛力。核酸適體（aptamer）是一類新型識別分子，有較強親和力和較高的選擇性，幾年來在生物檢測和新藥開發(fā)等方面應用廣泛。 本文以NS5A為靶標蛋白，篩選出與之特異結(jié)合的aptamers，研究其對HCV生活周期的影響，，并對aptamers的抗病毒機制做了初步的研究。本文將已構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET28b-NS5A轉(zhuǎn)到BL21大腸桿菌感受態(tài)細胞中進行蛋白表達，利用重組蛋白上連接的His標簽，用鎳柱純化得到目的蛋白。以純化的NS5A為靶蛋白，經(jīng)過8輪篩選，得到特異性結(jié)合的ssDNA aptamers。從中選擇五條（NS5A-1、NS5A-2、NS5A-3、NS5A-4、NS5A-5）進行分析，發(fā)現(xiàn)這五條aptamers能夠特異結(jié)合到NS5A蛋白上，且不與對照蛋白LacZ發(fā)生非特異性結(jié)合。利用分子生物學和免疫學方法檢測aptamers處理后細胞中的病毒RNA復制和病毒顆粒組裝或釋放的變化。將NS5A蛋白分段真核表達，利用細胞內(nèi)競爭實驗初步確定NS5A aptamers和NS5A的結(jié)合區(qū)域。確定aptamers和NS5A的結(jié)合區(qū)段后，進一步對aptamers能夠抑制病毒顆粒產(chǎn)生的機制進行研究。結(jié)果表明NS5A-4結(jié)合NS5A Domain I，對病毒RNA的復制有明顯的抑制作用，并且能抑制NS5A在脂滴上的定位。NS5A-5對病毒顆粒的組裝有抑制作用，通過抑制NS5A和Core的結(jié)合及病毒蛋白與病毒RNA的結(jié)合而實現(xiàn)。 結(jié)論：NS5A aptamers通過抑制NS5A在脂滴上的定位以及與Core蛋白之間的相互結(jié)合，發(fā)揮抗病毒作用。針對NS5A aptamers抗病毒作用機制的研究能幫助我們更深入了解HCV生活周期，從而為HCV靶向治療的研究提供新思路。
【關(guān)鍵詞】：丙型肝炎病毒 NS5A蛋白 核酸適體 抗病毒
【學位授予單位】：湖南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R512.63
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 第1章 緒論10-20
• 1.1 丙型肝炎病毒（HCV）及其研究概況10-16
• 1.1.1 丙型肝炎病毒基因組結(jié)構(gòu)和蛋白的功能10-11
• 1.1.2 丙型肝炎病毒生活周期11-13
• 1.1.3 丙型肝炎流行現(xiàn)狀13
• 1.1.4 抗丙型肝炎病毒藥物的研究13-16
• 1.2 丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白 5A 的研究概況16-17
• 1.3 核酸適體在生物醫(yī)藥研究中的應用17-19
• 1.4 本課題研究方案及目的19-20
• 第2章 丙型肝炎病毒全長 NS5A 蛋白原核表達及純化20-26
• 2.1 前言20
• 2.2 材料與方法20-24
• 2.2.1 實驗材料20-21
• 2.2.2 實驗方法21-24
• 2.3 實驗結(jié)果24
• 2.4 小結(jié)與討論24-26
• 第3章 NS5A 蛋白核酸適體的篩選26-30
• 3.1 前言26
• 3.2 材料與方法26-28
• 3.2.1 實驗材料26
• 3.2.2 實驗方法26-28
• 3.3 實驗結(jié)果28-29
• 3.3.1 不同篩選輪數(shù) aptamers 和蛋白的結(jié)合情況28
• 3.3.2 Aptamers 和 NS5A 蛋白的親和性的檢測28-29
• 3.4 小結(jié)與討論29-30
• 第4章 NS5A 核酸適體對 HCV 生活周期的影響30-45
• 4.1 前言30
• 4.2 材料與方法30-37
• 4.2.1 實驗材料30-31
• 4.2.2 實驗方法31-37
• 4.3 實驗結(jié)果37-43
• 4.3.1 NS5A aptamers 抑制 FCA1 細胞中復制子的復制37-39
• 4.3.2 NS5A aptamers 影響可感染 HCV 細胞系中病毒 RNA 的復制以及病毒顆粒的組裝39-41
• 4.3.3 NS5A aptamers 影響不同基因亞型 HCV RNA 的復制41-42
• 4.3.4 NS5A aptamers 不影響 HepG2.2.15 細胞系中 HBV DNA 的復制42-43
• 4.4 小結(jié)與討論43-45
• 第5章 NS5A 核酸適體抗病毒機制的探究45-62
• 5.1 前言45-46
• 5.2 材料與方法46-53
• 5.2.1 實驗材料46-47
• 5.2.2 實驗方法47-53
• 5.3 實驗結(jié)果53-60
• 5.3.1 pEF6/V5-His TOPO-NS5A DI、pEF6/V5-His TOPO-NS5A DI-II、pEF6/V5-His TOPO-NS5A DI-III 重組質(zhì)粒的構(gòu)建53-57
• 5.3.2 NS5A Domain I 與 NS5A-4 的抗病毒作用有關(guān)57-58
• 5.3.3 NS5A-4 抑制細胞內(nèi)病毒 NS5A 在 LDs 上的定位58
• 5.3.4 NS5A-5 抑制細胞內(nèi) HCV NS5A 與 Core 蛋白的相互作用58-59
• 5.3.5 NS5A aptamers 抑制細胞內(nèi) HCV Core 蛋白與 RNA 的結(jié)合59-60
• 5.4 小結(jié)與討論60-62
• 結(jié)論62-63
• 參考文獻63-71
• 致謝71-72
• 附錄 攻讀學位期間參與項目及發(fā)表論文72

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本文編號：360628