本文關(guān)鍵詞：肝硬化門脈高壓下miR-9a-5p介導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞的持續(xù)活化的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景與目的門脈高壓癥是一種血液動(dòng)力學(xué)異常疾病,表現(xiàn)為門靜脈壓力增高進(jìn)一步導(dǎo)致腹水、食管胃底靜脈曲張及脾腫大,也可伴有多種并發(fā)癥如上肝性腦病、消化道出血及肝。腎綜合征。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC)的持續(xù)激活是肝硬化門脈高壓癥的發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。肝星狀細(xì)胞具有很強(qiáng)的收縮性,主要表現(xiàn)在調(diào)節(jié)肝竇血流方面,其作用類似于平滑肌細(xì)胞。其機(jī)制是肝星狀細(xì)胞分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)和向肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞遷移,造成肝細(xì)胞腫脹和血管阻力增加,進(jìn)而造成門脈壓力的增高。miRNA是最近幾年研究較多的一類非編碼小RNA,長(zhǎng)度大約在22nt,主要機(jī)制是結(jié)合靶基因的3'UTR端,通過抑制其表達(dá)從而調(diào)控細(xì)胞的功能。在肝纖維化的研究中也發(fā)現(xiàn),miRNA在HSC的活化、增殖及凋亡中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。但是,在HSC對(duì)門脈高壓的力學(xué)響應(yīng)中miRNA是否起作用,目前國(guó)內(nèi)外均尚未見報(bào)道。因此,本論文研究目的旨在研究miRNA在肝星狀細(xì)胞門脈高壓時(shí)生物力學(xué)應(yīng)答中所起的調(diào)節(jié)作用,為門脈高壓的防治提出新的思路和策略,為miRNA在肝硬化門脈高壓防治上提供了理論基礎(chǔ)和應(yīng)用的可能性。本研究應(yīng)用HSC壓力加載模型,通過miRNA二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)HSC力學(xué)加載前后miRNA表達(dá)譜(加載的HSC選用14天完全活化的細(xì)胞)。在這些差異表達(dá)的miRNAs之中,miR-9a-5p能夠明顯的升高,并通過RT-PCR驗(yàn)證。我們的前期研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn),壓力(10 mmHg壓力作用1h)能顯著促進(jìn)HSC的增殖、活化和遷移(10 mmHg為門脈高壓發(fā)生的臨界壓力值),其作用可能是通過Integrin-FAK途徑實(shí)現(xiàn),而AKT又是其下游通路。通過轉(zhuǎn)染miR-9a-5p,研究肝星狀細(xì)胞在壓力下改變miR-9a-5p的表達(dá)后對(duì)其活化、遷移與增殖功能的影響及機(jī)制。該研究一共分三個(gè)部分：(1)原代大鼠肝星狀細(xì)胞的分離和鑒定；(2)壓力誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞microRNA表達(dá)譜及生物信息學(xué)分析；(3)miR-9a-5p在肝硬化門脈高壓中的作用及其相關(guān)調(diào)控機(jī)制的研究。方法1 原代肝星狀細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定：剛分離的原代細(xì)胞以1×105cells/cm2種植于20%的FBS培養(yǎng)液中,培養(yǎng)48h后,將培養(yǎng)液更換為含10%的FBS。每隔一天換一次液體。培養(yǎng)2天內(nèi)的細(xì)胞均為靜息期,第14天為完全活化細(xì)胞。原代細(xì)胞純度鑒定通過自發(fā)免疫熒光和抗Desmin和a-SMA的細(xì)胞免疫熒光。2 壓力加載：取培養(yǎng)14天的原代肝星狀細(xì)胞置于壓力裝置內(nèi),分別連接氮?dú)夂脱獕河?jì),并開啟血壓計(jì)緩慢注入氮?dú)?壓力上升至10 mmHg后,關(guān)閉閥門密封容器,加載1小時(shí)可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.1 壓力誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞microRNA表達(dá)譜及生物信息學(xué)分析：2.2 肝星狀細(xì)胞體外培養(yǎng)14天作為對(duì)照組HSC；培養(yǎng)14天后在10mmHg下作用1小時(shí)作為壓力組HSC。2.3 生物信息學(xué)分析：Gene ontology(GO)分析--應(yīng)用GO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異基因進(jìn)行分析,取得有可能參與的功能,并尋找microRNA與差異基因可能的關(guān)系：pathway分析—根據(jù)KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù),得到表達(dá)顯著的信號(hào)通路,并尋找microRNA與信號(hào)通路可能的關(guān)系。3 miR-9a-5p在壓力作用下肝星狀細(xì)胞與大鼠肝硬化肝組織中的驗(yàn)證3.1 HSC在壓力作用下miR-9a-5p的表達(dá)檢測(cè)：應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)壓力作用的HSC與正常培養(yǎng)HSC的miR-9a-5p的表達(dá)量變化。3.2 miR-9a-5p在晚期肝硬化大鼠肝組織中的表達(dá)分析3.2.1 CCl4肝硬化動(dòng)物模型的構(gòu)建：對(duì)照組每周兩次腹腔注射橄欖油2ml/kg,實(shí)驗(yàn)組每周兩次腹腔注射40%CCl4 2ml/kg。首劑量加倍,正常飲水?dāng)z食。一共八周。3.2.2應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)正常大鼠肝組織與肝硬化大鼠肝組織的miR-9a-5p的表達(dá)量變化。4 壓力作用下對(duì)HSC功能的檢測(cè)4.1 使用RT-PCR方法,檢測(cè)肝星狀細(xì)胞在壓力作用下,a-SMA mRNA與Type I collagen表達(dá)量的改變。4.2 使用western blot方法,檢測(cè)肝星狀細(xì)胞在壓力作用下,a-SMA mRNA與Type I collagen表達(dá)量的改變。5 MiRNA mimics和inhibitors轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞用瑞博FECTTM CP試劑盒,miR-9a-5pinhibitor和mimic購(gòu)買自廣州瑞博公司,轉(zhuǎn)染濃度分別為100nM和50nM。轉(zhuǎn)染24-48小時(shí)后收集細(xì)胞。6 壓力作用下對(duì)HSC增殖的檢測(cè)miR-9a-5p轉(zhuǎn)染與壓力作用1小時(shí)后,1×105cells/ml密度種植于96孔板中并培養(yǎng)24、48和72小時(shí),用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖率。7 壓力作用下對(duì)HSC遷移的檢測(cè)Transwell:miR-9a-5p轉(zhuǎn)染與壓力作用1小時(shí)后,以5×103cells/well接種100 ul細(xì)胞懸液于Transwell 24孔培養(yǎng)板中,藍(lán)染Transwell的上部和底部細(xì)胞膜。遷移后24小時(shí),用顯微鏡隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察計(jì)算遷移細(xì)胞數(shù)目。8 miR-9a-5p的靶基因?qū)ふ壹膀?yàn)證應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因與western blot檢測(cè)miR-9a-5p與Sirtl之間存在靶向關(guān)系。9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,三樣本獨(dú)立重復(fù)。兩組數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn),三組或多組數(shù)據(jù)用單因素方差分析。數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件處理,p≤0.05被視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1 原代肝星狀細(xì)胞鑒定和培養(yǎng)：分離的原代HSC種植于培養(yǎng)皿后,表現(xiàn)為形態(tài)均一的發(fā)光的小圓形細(xì)胞,體積遠(yuǎn)小于肝細(xì)胞。培養(yǎng)當(dāng)天細(xì)胞可大部分貼壁,表現(xiàn)為富含脂肪顆粒的橢圓形。培養(yǎng)第7天細(xì)胞可伸展為細(xì)長(zhǎng)型.培養(yǎng)第14天,細(xì)胞可向四周伸展,并表現(xiàn)為明顯的星狀.在細(xì)胞貼壁2天左右,328 nm紫外光照射下,細(xì)胞表現(xiàn)為黃綠色熒光,培養(yǎng)14天做細(xì)胞免疫熒光,Desmin和α-SMA均為表達(dá)陽(yáng)性。2 microRNA在壓力作用肝星狀細(xì)胞下的表達(dá)譜及生物信息學(xué)分析2.1 18個(gè)microRNA (miR-206-3p、miR-210-3p、miR-494-5p、miR-345-3p、 miR-592、miR-124-3p、miR-429、miR-34c-5p、miR-34b-5p、miR-34a-3p、 miR-450a-3p、miR-199a-5p、miR-222-3p、miR-450a-5p、-miR-34a-5p、 miR-494-3p、miR-377-5p、miR-9a-5p)在壓力作用肝星狀細(xì)胞中表達(dá)升高；7個(gè)microRNA(miR-26a-3p、miR-222-5p、miR-335、miR-194-3p、 miR-103-1-5p、miR-664-1-5p、miR-188-3p)在壓力作用肝星狀細(xì)胞中表達(dá)降低。2.2 GO分析和pathway分析：15個(gè)GOs被上調(diào)的miRNAs調(diào)控,15個(gè)GOs被下調(diào)的miRNAs調(diào)控。所有的miRNAs調(diào)控的GOs與細(xì)胞周期、成纖維細(xì)胞增殖的負(fù)反饋調(diào)節(jié)、自噬正反饋調(diào)節(jié)、視黃酸反應(yīng)、K48蛋白脫泛素化、K63蛋白脫泛素化、基因表達(dá)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。miRNAs調(diào)節(jié)的關(guān)鍵信號(hào)通路：RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、粘附斑激酶、白細(xì)胞介素信號(hào)通路、細(xì)胞粘附分子等。3 miR-9a-5p在壓力作用下肝星狀細(xì)胞與大鼠肝硬化肝組織中的驗(yàn)證應(yīng)用RT-PCR證實(shí)：壓力作用的HSC比正常培養(yǎng)HSC的miR-9a-5p的表達(dá)量顯著升高,與二代測(cè)序結(jié)果一致。肝硬化大鼠肝組織比正常大鼠肝組織的miR-9a-5p表達(dá)量顯著升高。4 miR-9a-5p在壓力作用下對(duì)HSC功能的影響應(yīng)用RT-PCR和western blot證實(shí),轉(zhuǎn)染miR-9a-5p進(jìn)入14天活化肝星狀細(xì)胞,壓力作用1小時(shí)后,a-SMA和Type I collagen的表達(dá)量受到miR-9a-5p的抑制(p0.05)。5 miR-9a-5p在壓力作用下對(duì)HSC增殖的影響CCK-8實(shí)驗(yàn)表明,抑制miR-9a-5p,可以明顯抑制壓力作用HSC的增殖。6 miR-9a-5p在壓力作用下對(duì)HSC遷移的影響Transwell實(shí)驗(yàn)表明,抑制miR-9a-5p,可以明顯抑制壓力作用HSC的遷移。7 miR-9a-5p的靶基因?qū)ふ壹膀?yàn)證熒光素酶報(bào)告顯示,經(jīng)過miR-9a-5p mimic處理的野生型Sir13'UTR是明顯的降低。Western blot也證實(shí),轉(zhuǎn)染miR-9a-5p inhibitor, Sirtl蛋白表達(dá)升高；轉(zhuǎn)染miR-9a-5p mimic, Sirtl蛋白表達(dá)降低。8 Sirtl在壓力作用細(xì)胞和晚期肝硬化大鼠肝組織中的表達(dá)分析通過RT-PCR和免疫組化證實(shí),Sirtl的表達(dá)量在壓力處理的肝星狀細(xì)胞和大鼠肝纖維化晚期組織中明顯降低。9 miR-9a-5p參與了在壓力作用下PI3K-AKT信號(hào)通路對(duì)HSC的調(diào)節(jié)Western blot證實(shí),PI3K通路抑制劑LY294002能夠在壓力作用下顯著抑制AKT磷酸化。通過RT-PCR進(jìn)一步證實(shí),LY294002也能夠使miR-9a-5p的表達(dá)量降低。結(jié)論1 通過二代測(cè)序技術(shù)和RT-PCR篩選出壓力作用下14天活化肝星狀細(xì)胞的miRNAs的表達(dá),其中miR-9a-5p的表達(dá)量顯著升高。通過構(gòu)建肝纖維化大鼠模型證實(shí),miR-9a-5p在組織中表達(dá)量也是升高。熒光素酶報(bào)告和western blot證實(shí)miR-9a-5p的靶基因?yàn)镾irtl,在細(xì)胞與組織中均降低。2 抑制miR-9a-5p的表達(dá),能夠顯著抑制HSC的活化、增殖和遷移。過表達(dá)Sirtl能夠抑制HSC的活化�？赡芡ㄟ^下調(diào)Sirtl的表達(dá)量來實(shí)現(xiàn)的。3 通過對(duì)壓力作用下Akt磷酸化的抑制,發(fā)現(xiàn)miR-9a-5pde表達(dá)量降低。而在Erkl/2抑制劑的作用下,miR-9a-5p表達(dá)量沒有改變。
【關(guān)鍵詞】：microRNA miR-9a-5p Sirt1 肝星狀細(xì)胞 活化 增殖 遷移 壓力
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R575.2
【目錄】：

• 摘要6-10
• Abstract10-16
• 縮略詞表16-17
• 前言17-20
• 參考文獻(xiàn)18-20
• 第一部分 大鼠肝星狀細(xì)胞的分離與鑒定20-29
• 前言20-21
• 材料與方法21-24
• 結(jié)果24-26
• 討論26-27
• 第一部分 小結(jié)27-28
• 參考文獻(xiàn)28-29
• 第二部分 壓力誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞microRNA表達(dá)譜及生物信息學(xué)分析29-48
• 前言29-31
• 材料和方法31-36
• 結(jié)果36-43
• 討論43-45
• 第二部分 小結(jié)45-46
• 參考文獻(xiàn)46-48
• 第三部分 壓力誘導(dǎo)miR-9a-5p介導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞持續(xù)活化的分子機(jī)理研究48-68
• 前言48-49
• 材料和方法49-55
• 結(jié)果55-63
• 討論63-65
• 第三部分 小結(jié)65-66
• 參考文獻(xiàn)66-68
• 全文總結(jié)68-69
• 綜述69-78
• 參考文獻(xiàn)73-78
• 在讀期間發(fā)表或待發(fā)表文章78
• 在讀期間參加課題78-79
• 致謝79

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 羅海峰,吳志勇,陳煒,邱江鋒,張燕;大鼠肝星狀細(xì)胞的原代分離、培養(yǎng)與鑒定[J];肝膽胰外科雜志;2003年04期

2 陳超;陳寧;覃霞;朱j;;一種改良的肝星狀細(xì)胞分離方法[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2011年06期

  本文關(guān)鍵詞：肝硬化門脈高壓下miR-9a-5p介導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞的持續(xù)活化的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：350606