本文關(guān)鍵詞：去乙�；窼irt3對(duì)腸上皮屏障功能的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景及目的 腸黏膜屏障是機(jī)體防御的重要屏障，多種急慢性病理?xiàng)l件誘發(fā)腸粘膜屏障功能(IBF)損傷的共同機(jī)制可能是腸粘膜缺氧，各種手術(shù)應(yīng)激、創(chuàng)傷等病理?xiàng)l件都會(huì)導(dǎo)致腸道的局部缺氧，進(jìn)而破壞緊密連接蛋白(TJs)，影響該屏障的功能。而在這一過(guò)程中缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)起著重要作用。去乙酰化酶Sirt3是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴型的組蛋白去乙�；讣易宓闹匾蓡T之一。其在能量代謝、基因沉默、DNA損傷修復(fù)、有絲分裂調(diào)控及抗凋亡等方面起著重要的作用。而有關(guān)缺氧條件下去乙�；窼irt3能否調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子，減輕腸屏障功能受損的報(bào)道目前尚少。我們采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)及對(duì)腸上皮細(xì)胞的缺氧處理，觀察Sirt3對(duì)缺氧誘導(dǎo)因子-1α及腸屏障功能的影響。緊密連接是構(gòu)成腸道黏膜機(jī)械屏障上皮細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu)，可防止腸道有害物質(zhì)侵入腸黏膜組織，維持腸上皮的通透性和細(xì)胞的極性。腸粘膜屏障功能調(diào)控與腸粘膜局部的缺氧密切相關(guān)。 目前研究已表明在諸如感染性休克、內(nèi)毒血癥、缺血再灌注、炎癥性腸病等多種急慢性病理情況下，都會(huì)發(fā)生腸粘膜的局部缺氧，這種粘膜缺氧又會(huì)與炎癥反應(yīng)協(xié)同作用，而大量炎癥因子也會(huì)加劇缺氧造成的腸粘膜屏障功能損傷造成細(xì)菌和(或)內(nèi)毒素入血引發(fā)腸源性感染、全身性炎癥反應(yīng)、MODS等，而缺氧誘導(dǎo)因子是這一過(guò)程的重要調(diào)節(jié)因子，部分HIF-1α缺失可以減輕腸道缺血缺氧造成的損傷。 Sirtuins或沉默信息調(diào)節(jié)蛋白2(Silencing information regulator2, S-ir2)類似酶是一個(gè)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴型的組蛋白去乙�；傅募易�,Sirt3屬于該家族的成員之一。目前大量研究證明，Sirt3在慢性損傷過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，尤其是Sirt3可以抑制與腫瘤發(fā)生相關(guān)的瓦博格效應(yīng)，從而減少腫瘤的突變概率。 HIF-1α作為與缺氧狀態(tài)密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，擔(dān)負(fù)著重要的腸粘膜屏障調(diào)節(jié)者的角色。為此，在本實(shí)驗(yàn)中我們采用RNA干擾技術(shù)首先驗(yàn)證Sirt3對(duì)HIF-1α是否有調(diào)控作用。由于Sirt3在腸道中相對(duì)較少，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中對(duì)其在常氧狀態(tài)下蛋白和mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，從而確保了實(shí)驗(yàn)的可行性。在研究中發(fā)現(xiàn)Sirt3在常氧與缺氧的不同時(shí)段表達(dá)并無(wú)明顯差異。在常氧+Sirt3-siRNA組蛋白幾乎沒(méi)有表達(dá)，說(shuō)明干擾效果較好;在缺氧+Sirt3-siRNA組Sirt3蛋白仍有表達(dá)，這可能與干擾效率相關(guān)。而HIF-1α在缺氧6h表達(dá)最明顯，這與我們前期的研究結(jié)論一致。同時(shí)HIF-1α蛋白表達(dá)升高時(shí)，mRNA在常氧和低氧條件下變化不明顯，這與文獻(xiàn)報(bào)道的其在食管癌與膀胱癌中的變化相符。由于HIF-1α是一個(gè)具有中樞性意義的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可以通過(guò)多個(gè)通路作用于緊密連接蛋白來(lái)執(zhí)行應(yīng)激和病理?xiàng)l件下的腸粘膜屏障調(diào)節(jié)機(jī)制，因此我們也對(duì)緊密連接蛋白及腸屏障功能的變化進(jìn)行了研究。 研究方法 1.細(xì)胞培養(yǎng)：Caco-2細(xì)胞在37℃、5%co2、飽和濕度條件下用含20%胎牛血清MEM培養(yǎng)基培養(yǎng),用0.25%胰酶消化傳代。 2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：細(xì)胞接種至六孔板后，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到30%-50%時(shí)，各取5μl/孔Lipofectamine2000、Sirt3-siRNA用250μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium稀釋，室溫孵育5min;將兩者混合室溫靜置20min，然后加入含細(xì)胞的孔中，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后將培養(yǎng)基換為含血清的完全培養(yǎng)基。3.細(xì)胞分組及處理：待細(xì)胞培養(yǎng)96h后，將細(xì)胞的培養(yǎng)基更換為1ml不含胎牛血清的MEM培養(yǎng)液,分別行常氧處理(正常對(duì)照組Nx、常氧+Sirt3-siRNA組)、缺氧6h處理(1%O2Hx組，缺氧6h+Sirt3-siRNA組)。將細(xì)胞置于37℃培養(yǎng)箱中，不間斷通入含有體積分?jǐn)?shù)為：1%O2,5%co2的混合氣體培養(yǎng)6h。 4.RNA的提取及RT-PCR:細(xì)胞缺氧6h后，使用冷鹽酸緩沖液(PBS)漂洗3次，每孔中加入Trizol,按照Trizol說(shuō)明書提取總RNA。總RNA定量后取1μg按照PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，體系為20μl，合成CDNA。RT-PCR擴(kuò)增條件：955min,9445s,58℃30s,72℃45s,共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。取8μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(110v，35min)，采用Kodak Molecular Imaging軟件分析相對(duì)定量。 5.蛋白提取與Western blot檢測(cè)：使用PBS將缺氧6h后的細(xì)胞漂洗3次，每孔中加入預(yù)冷混有10μl的苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液100μl，冰上放置30min,12000xg4℃離心15min。使用蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定上清液蛋白含量。蛋白上樣后70V電泳，蛋白跑過(guò)上層膠后，改為100V電泳1.5h；200v恒流濕轉(zhuǎn)2h至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜后使用50g/l的脫脂奶粉封閉2h，加入Sirt3、Occludin、Claudin-1、Zo-1、HIF-1α、GAPDH一抗后4℃冰箱過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次10min。將化學(xué)發(fā)光試劑均勻滴加在目的蛋白上，使用圖像分析系統(tǒng)采集發(fā)光信號(hào)后，，再通過(guò)KodakMolecular Imaging軟件進(jìn)行密度分析，將其與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的灰度比值當(dāng)作目的蛋白的表達(dá)量。 6.腸上皮細(xì)胞跨上皮電阻(TER)測(cè)定： Caco-2細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于Transwell小室微孔膜上培養(yǎng)，每日定時(shí)更換培養(yǎng)基，測(cè)定細(xì)胞TER，當(dāng)測(cè)定的值達(dá)到穩(wěn)定后(4d),進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。處理分為4組(具體分組同上),每個(gè)處理組取3個(gè)孔,重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。 TER值按照原始數(shù)值減去空白對(duì)照數(shù)值(Rcell monolayer=Rsample-Rblank)表示,結(jié)果表示為處理后的值占處理前的百分比。 7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。 研究結(jié)果 1、Sirt3與HIF-1α蛋白表達(dá)變化。Western blot分析Sirt3和HIF-1α不同處理組的變化：Nx+Sirt3-siRNA組Sirt3蛋白表達(dá)較Nx組下降52%； Hx+Sirt3-siRNA組Sirt3蛋白表達(dá)較Hx組下降35%。Nx+Sirt3-siRNA組HIF-1α蛋白表達(dá)升高(0.72±0.01)，較Nx組上升約89.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)； Hx+Sirt3-siRNA組HIF-1α蛋白表達(dá)升高(0.93±0.01)，較Hx組升高約14.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。。 2、腸上皮細(xì)胞TJs的蛋白水平的變化：采用Western blot法，檢測(cè)2%O2Hx組和缺氧6h+Sirt3-siRNA組蛋白的變化，分別與常氧組及常氧+Sirt3-siRNA組進(jìn)行比較，TJs選用ZO-1、Occludin、Claudin-1，此3種分子在缺氧+Sirt3-siRNA組的蛋白水平(0.72±0.02、0.71±0.03、0.69±0.01)較Hx組下降22%、20%、12%差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)而常氧+Sirt3-siRNA組TJs的蛋白水平與Nx組蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。 3、腸上皮細(xì)胞TJs的mRNA水平的變化：采用RT-PCR法，檢測(cè)2%O2Hx組和缺氧6h+Sirt3-siRNA組mRNA的變化，分別與常氧組進(jìn)行比較。ZO-1、Occludin、Claudin-1的mRNA在缺氧+Sirt3-siRNA組的水平(0.88±0.03、0.80±0.01、0.84±0.01)較Hx組下降約22%、40%、28%差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。較Nx組下降42%、62%、32%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。而常氧+Sirt3-siRNA組TJs的mRNA水平與Nx組表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。 4、腸上皮電阻的變化：Nx+Sirt3-siRNA組TER值與Nx組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)，而Hx+Sirt3-siRNA組TER下降明顯(36.17±3.81)%較Hx組(52.26±2.68)%下降30.8%，與常氧對(duì)照組(102.58±2.31)%比較下降64.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01),證明沉默Sirt3,可使腸上皮TER降低，造成腸上皮通透性不穩(wěn)定。 結(jié)論 1. SIRT3調(diào)節(jié)HIF1α穩(wěn)定。常氧與缺氧條件下Sirt3的表達(dá)變化無(wú)明顯差異，而在缺氧條件下HIF-1α表達(dá)比常氧條件下明顯升高，其中缺氧六小時(shí)表達(dá)最高。在缺氧條件下(6H)沉默Sirt3，發(fā)現(xiàn)HIF-1α的表達(dá)升高，說(shuō)明Sirt3對(duì)HIF-1α有調(diào)控作用。 2.沉默緊密連接蛋白的表達(dá)下降。缺氧條件下經(jīng)過(guò)SIRT3-siRNA轉(zhuǎn)染后緊密連接蛋白的mRNA蛋白表達(dá)比轉(zhuǎn)染前明顯降低。而在常氧和常氧轉(zhuǎn)染組則沒(méi)有明顯變化。 3. SIRT3通過(guò)調(diào)控HIF1α的穩(wěn)定性，影響腸粘膜屏障功能。
【關(guān)鍵詞】：RNA干擾 去乙�；窼irt3 缺氧誘導(dǎo)因子-1 緊密連接蛋白
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R574
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-6
• Abstract6-11
• 摘要11-15
• 第一章 前言15-18
• 第二章 缺氧條件下 SIRT3 及 HIF-1Α的表達(dá)變化18-35
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料18-22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法22-32
• 2.3 結(jié)果32-34
• 2.4 討論34-35
• 第三章 缺氧條件下SIRT3對(duì)腸上皮屏障功能的作用35-42
• 3.1 材料與方法35-37
• 3.2 結(jié)果37-40
• 3.3 討論40-42
• 全文結(jié)論42-43
• 參考文獻(xiàn)43-46
• 文獻(xiàn)綜述 去乙酰化酶 SIRT3 研究進(jìn)展46-58
• 參考文獻(xiàn)53-58
• 碩士研究生期間撰寫和發(fā)表的文章58-59
• 致謝59

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 ;Over-starvation aggravates intestinal injury and promotes bacterial and endotoxin translocation under high-altitude hypoxic environment[J];World Journal of Gastroenterology;2011年12期

  本文關(guān)鍵詞：去乙�；窼irt3對(duì)腸上皮屏障功能的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：350549