IL-17調(diào)控肝細(xì)胞參與肝臟損傷與修復(fù)
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【摘要】:【背景】肝纖維化是肝臟受到各種急慢性刺激后引發(fā)的損傷修復(fù)反應(yīng)。導(dǎo)致肝纖維化的主要病因有慢性病毒性肝炎、酒精性肝病以及非酒精性脂肪肝等。若損傷因素持續(xù)存在,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)不斷聚集,肝纖維化逐步進(jìn)展為肝硬化。一旦發(fā)展為肝硬化,其并發(fā)癥多、預(yù)后差、死亡率高,嚴(yán)重危害人類健康。因此,肝硬化的發(fā)生機(jī)制受到越來(lái)越多的關(guān)注。大量研究顯示細(xì)胞因子(如TGF-β1、TNF-、PDGF)、肝星狀細(xì)胞、枯否細(xì)胞等均參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展,但是不能完全解釋肝纖維化的發(fā)病機(jī)制。近年來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道,白細(xì)胞介素17(Interleukin-17,IL-17)可以促進(jìn)肺纖維化。在多種肝臟疾病中,外周血IL-17升高并且與肝損傷的嚴(yán)重程度呈正相關(guān),如酒精性肝病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、病毒性肝炎(尤其乙型病毒性肝炎)、非酒精性脂肪肝等。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),四氯化碳(Carbon tetrachloride, CCl4)誘導(dǎo)小鼠肝纖維化以及自然恢復(fù)過(guò)程中,外周血IL-17水平呈動(dòng)態(tài)變化且與肝纖維化程度密切相關(guān);注射外源性的重組小鼠IL-17可以促進(jìn)肝損傷;抗小鼠IL-17抗體可以減輕CCl4誘導(dǎo)的肝損傷。目前IL-17在肝臟內(nèi)的表達(dá)水平尚不清楚。有研究證實(shí)IL-17可以直接激活肝星狀細(xì)胞、促進(jìn)枯否細(xì)胞分泌TGF-β1進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化。占肝臟總體積80%的肝細(xì)胞是否受到IL-17的影響呢?有學(xué)者認(rèn)為IL-17可以減輕IFN-γ誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡,也有學(xué)者認(rèn)為IL-17對(duì)肝細(xì)胞不發(fā)揮作用。因此我們采用CCl4腹腔連續(xù)注射的方法誘導(dǎo)小鼠肝損傷模型以及CCl4干預(yù)原代培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞模型,探討小鼠肝損傷模型中肝臟內(nèi)IL-17變化情況、肝細(xì)胞表面白細(xì)胞介素17受體(Interleukin-17recepter, IL-17R)的表達(dá)、IL-17對(duì)肝細(xì)胞的作用以及IL-17在肝細(xì)胞活化枯否細(xì)胞以及肝星狀細(xì)胞的作用。進(jìn)一步探討IL-17在肝纖維化/肝硬化中的作用機(jī)制,有助于肝纖維化/肝硬化機(jī)制的闡明。 【目的】明確CCl4對(duì)小鼠肝內(nèi)IL-17表達(dá)的影響;確定IL-17對(duì)肝細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制;探索IL-17在肝細(xì)胞活化枯否細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞中的作用。 【方法】(1)腹腔注射CCl48周以誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型,8w后取小鼠肝臟、采集小鼠血清,前者用HE染色以及天狼星紅染色方法檢測(cè)小鼠肝臟損傷程度以及肝纖維化程度,后者用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠血清中ALB、AST以及ALT的水平;在肝纖維化造模過(guò)程中取造模小鼠肝臟組織,用ELISA方法檢測(cè)IL-17的表達(dá)水平;(2)分離小鼠肝細(xì)胞,用不同濃度的重組小鼠IL-17因子(Recombinant MouseIL-17, Rm IL-17)(5、10、15、20、25ng/ml)干預(yù)肝細(xì)胞,分別在干預(yù)24h、48h、72h后,用流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL方法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡;BrdU以及Ki-67方法檢測(cè)肝細(xì)胞增殖;ELISA檢測(cè)肝細(xì)胞分泌TGF-β1的水平。分離小鼠肝細(xì)胞,用6mM的CCl4預(yù)處理肝細(xì)胞1h用來(lái)建立體外肝細(xì)胞損傷模型,用上述不同濃度的Rm IL-17干預(yù)肝細(xì)胞,在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡、增殖以及分泌TGF-β1的水平,檢測(cè)方法同上。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)正常肝細(xì)胞以及體外損傷肝細(xì)胞表面IL-17R的表達(dá)量;Western blot方法檢測(cè)Caspase-3以及Bcl-2的表達(dá)量;(3)用不同濃度的Rm IL-17干預(yù)正常肝細(xì)胞或CCl4體外損傷肝細(xì)胞,并分別與小鼠枯否細(xì)胞或肝星狀細(xì)胞共培養(yǎng),前者用ELISA以及Real-time PCR方法檢測(cè)TGF-β1以及TNF-表達(dá)量;后者用Real-time PCR方法檢測(cè)-SMA、TGF-β1、基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP3)、金屬蛋白酶組織抑制劑1(TIMP1)和膠原層蛋白(Collagen-1)等肝纖維化相關(guān)因子的表達(dá)。 【結(jié)果】(1)腹腔注射CCl4第8w時(shí),小鼠肝組織HE染色和天狼星紅染色發(fā)現(xiàn)肝臟出現(xiàn)了顯著的纖維化,血生化檢測(cè)表明轉(zhuǎn)氨酶增高、白蛋白降低,提示成功建立了小鼠肝纖維化模型。 (2) ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在CCl4誘導(dǎo)建立小鼠肝纖維化的過(guò)程中,肝臟內(nèi)IL-17水平顯著升高,并具有時(shí)間依賴性。 (3)流式細(xì)胞術(shù)以及TUNEL染色表明:正常小鼠肝細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí),其自發(fā)性凋亡率為10%-15%。用CCl4處理原代培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞,可誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。在體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的過(guò)程中,加入Rm IL-17,發(fā)現(xiàn)IL-17可以顯著抑制肝細(xì)胞的自發(fā)凋亡和CCl4誘導(dǎo)凋亡。 (4) BrdU以及Ki-67染色表明,IL-17對(duì)原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響。 (5) ELISA結(jié)果顯示,IL-17對(duì)原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞分泌TGF-β1無(wú)明顯影響。 (6)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),正常小鼠肝細(xì)胞表達(dá)一定水平的IL-17R,CCl4可顯著提高IL-17R在肝細(xì)胞上的表達(dá)水平。 (7) Western blot表明,IL-17可以上調(diào)Bcl-2在肝細(xì)胞的表達(dá),并抑制Caspase-3的活化。 (8)小鼠肝細(xì)胞與枯否細(xì)胞共培養(yǎng)可以誘導(dǎo)TGF-β1以及TNF-的表達(dá),經(jīng)IL-17預(yù)處理的肝細(xì)胞與枯否細(xì)胞共培養(yǎng),TGF-β1和TNF-的表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低。 (9)小鼠肝細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)可以誘導(dǎo)-SMA、TGF-β1、MMP3、Collagen-1以及TIMP1的表達(dá),,經(jīng)IL-17預(yù)處理的肝細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞共培養(yǎng),-SMA、TGF-β1、MMP3、Collagen-1以及TIMP1的表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低。 【結(jié)論】在CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷的過(guò)程中,肝內(nèi)IL-17和肝細(xì)胞IL-17R的表達(dá)水平均顯著升高;IL-17可以通過(guò)上調(diào)Bcl-2,抑制Caspase-3活化而抑制自發(fā)性的和CCl4誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡;IL-17預(yù)處理可以降低肝細(xì)胞對(duì)枯否細(xì)胞以及肝星狀細(xì)胞的活化效應(yīng);IL-17可能通過(guò)調(diào)控肝細(xì)胞凋亡參與肝臟損傷與修復(fù)。
【關(guān)鍵詞】:IL-17 肝纖維化 肝硬化 CCl4 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】:第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2014
【分類號(hào)】:R575.2
【目錄】:
- 縮略語(yǔ)表4-6
- 中文摘要6-9
- Abstract9-12
- 前言12-14
- 文獻(xiàn)回顧14-24
- 1. 肝纖維化/肝硬化在我國(guó)發(fā)病率高、預(yù)后差、死亡率高,目前尚缺乏有效治療手段。因此,對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究至關(guān)重要14-15
- 2. 肝纖維化/肝硬化發(fā)病機(jī)制的研究現(xiàn)狀15-16
- 3. 在肝纖維化/肝硬化中,肝細(xì)胞凋亡是最常發(fā)生的變化。肝細(xì)胞凋亡與炎癥以及肝纖維化均密切相關(guān)16-18
- 4. IL-1718-24
- 第一部分 CCL4對(duì)小鼠肝內(nèi) IL-17 表達(dá)的影響24-31
- 1 材料和儀器24-25
- 2 方法25-28
- 3 結(jié)果28-30
- 4 討論30-31
- 第二部分 IL-17 對(duì)肝細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制31-54
- 1 材料和儀器31-34
- 2 方法34-41
- 3 結(jié)果41-51
- 4 討論51-54
- 第三部分 IL-17 在肝細(xì)胞活化枯否細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞中的作用54-68
- 1 材料和儀器54-57
- 2 方法57-61
- 3 結(jié)果61-66
- 4 討論66-68
- 小結(jié)68-69
- 參考文獻(xiàn)69-77
- 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果77-78
- 致謝78
【共引文獻(xiàn)】
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