本文關(guān)鍵詞：IL-17調(diào)控肝細(xì)胞參與肝臟損傷與修復(fù)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：【背景】肝纖維化是肝臟受到各種急慢性刺激后引發(fā)的損傷修復(fù)反應(yīng)。導(dǎo)致肝纖維化的主要病因有慢性病毒性肝炎、酒精性肝病以及非酒精性脂肪肝等。若損傷因素持續(xù)存在，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)不斷聚集，肝纖維化逐步進(jìn)展為肝硬化。一旦發(fā)展為肝硬化，其并發(fā)癥多、預(yù)后差、死亡率高，嚴(yán)重危害人類健康。因此，肝硬化的發(fā)生機(jī)制受到越來(lái)越多的關(guān)注。大量研究顯示細(xì)胞因子（如TGF-β1、TNF-、PDGF）、肝星狀細(xì)胞、枯否細(xì)胞等均參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，但是不能完全解釋肝纖維化的發(fā)病機(jī)制。近年來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道，白細(xì)胞介素17（Interleukin-17，IL-17）可以促進(jìn)肺纖維化。在多種肝臟疾病中，外周血IL-17升高并且與肝損傷的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，如酒精性肝病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、病毒性肝炎（尤其乙型病毒性肝炎）、非酒精性脂肪肝等。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，四氯化碳（Carbon tetrachloride, CCl4）誘導(dǎo)小鼠肝纖維化以及自然恢復(fù)過(guò)程中，外周血IL-17水平呈動(dòng)態(tài)變化且與肝纖維化程度密切相關(guān)；注射外源性的重組小鼠IL-17可以促進(jìn)肝損傷；抗小鼠IL-17抗體可以減輕CCl4誘導(dǎo)的肝損傷。目前IL-17在肝臟內(nèi)的表達(dá)水平尚不清楚。有研究證實(shí)IL-17可以直接激活肝星狀細(xì)胞、促進(jìn)枯否細(xì)胞分泌TGF-β1進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化。占肝臟總體積80%的肝細(xì)胞是否受到IL-17的影響呢？有學(xué)者認(rèn)為IL-17可以減輕IFN-γ誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡，也有學(xué)者認(rèn)為IL-17對(duì)肝細(xì)胞不發(fā)揮作用。因此我們采用CCl4腹腔連續(xù)注射的方法誘導(dǎo)小鼠肝損傷模型以及CCl4干預(yù)原代培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞模型，探討小鼠肝損傷模型中肝臟內(nèi)IL-17變化情況、肝細(xì)胞表面白細(xì)胞介素17受體（Interleukin-17recepter, IL-17R）的表達(dá)、IL-17對(duì)肝細(xì)胞的作用以及IL-17在肝細(xì)胞活化枯否細(xì)胞以及肝星狀細(xì)胞的作用。進(jìn)一步探討IL-17在肝纖維化/肝硬化中的作用機(jī)制，有助于肝纖維化/肝硬化機(jī)制的闡明。 【目的】明確CCl4對(duì)小鼠肝內(nèi)IL-17表達(dá)的影響；確定IL-17對(duì)肝細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制；探索IL-17在肝細(xì)胞活化枯否細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞中的作用。 【方法】(1)腹腔注射CCl48周以誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型，8w后取小鼠肝臟、采集小鼠血清，前者用HE染色以及天狼星紅染色方法檢測(cè)小鼠肝臟損傷程度以及肝纖維化程度，后者用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠血清中ALB、AST以及ALT的水平；在肝纖維化造模過(guò)程中取造模小鼠肝臟組織，用ELISA方法檢測(cè)IL-17的表達(dá)水平；(2)分離小鼠肝細(xì)胞，用不同濃度的重組小鼠IL-17因子(Recombinant MouseIL-17, Rm IL-17)(5、10、15、20、25ng/ml)干預(yù)肝細(xì)胞，分別在干預(yù)24h、48h、72h后，用流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL方法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡；BrdU以及Ki-67方法檢測(cè)肝細(xì)胞增殖；ELISA檢測(cè)肝細(xì)胞分泌TGF-β1的水平。分離小鼠肝細(xì)胞，用6mM的CCl4預(yù)處理肝細(xì)胞1h用來(lái)建立體外肝細(xì)胞損傷模型，用上述不同濃度的Rm IL-17干預(yù)肝細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡、增殖以及分泌TGF-β1的水平，檢測(cè)方法同上。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)正常肝細(xì)胞以及體外損傷肝細(xì)胞表面IL-17R的表達(dá)量；Western blot方法檢測(cè)Caspase-3以及Bcl-2的表達(dá)量；(3)用不同濃度的Rm IL-17干預(yù)正常肝細(xì)胞或CCl4體外損傷肝細(xì)胞，并分別與小鼠枯否細(xì)胞或肝星狀細(xì)胞共培養(yǎng)，前者用ELISA以及Real-time PCR方法檢測(cè)TGF-β1以及TNF-表達(dá)量；后者用Real-time PCR方法檢測(cè)-SMA、TGF-β1、基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP3）、金屬蛋白酶組織抑制劑1（TIMP1）和膠原層蛋白(Collagen-1)等肝纖維化相關(guān)因子的表達(dá)。 【結(jié)果】(1)腹腔注射CCl4第8w時(shí)，小鼠肝組織HE染色和天狼星紅染色發(fā)現(xiàn)肝臟出現(xiàn)了顯著的纖維化，血生化檢測(cè)表明轉(zhuǎn)氨酶增高、白蛋白降低，提示成功建立了小鼠肝纖維化模型。 (2) ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在CCl4誘導(dǎo)建立小鼠肝纖維化的過(guò)程中，肝臟內(nèi)IL-17水平顯著升高，并具有時(shí)間依賴性。 (3)流式細(xì)胞術(shù)以及TUNEL染色表明：正常小鼠肝細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，其自發(fā)性凋亡率為10%-15%。用CCl4處理原代培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞，可誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。在體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，加入Rm IL-17，發(fā)現(xiàn)IL-17可以顯著抑制肝細(xì)胞的自發(fā)凋亡和CCl4誘導(dǎo)凋亡。 (4) BrdU以及Ki-67染色表明，IL-17對(duì)原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響。 (5) ELISA結(jié)果顯示，IL-17對(duì)原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞分泌TGF-β1無(wú)明顯影響。 (6)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，正常小鼠肝細(xì)胞表達(dá)一定水平的IL-17R，CCl4可顯著提高IL-17R在肝細(xì)胞上的表達(dá)水平。 (7) Western blot表明，IL-17可以上調(diào)Bcl-2在肝細(xì)胞的表達(dá)，并抑制Caspase-3的活化。 (8)小鼠肝細(xì)胞與枯否細(xì)胞共培養(yǎng)可以誘導(dǎo)TGF-β1以及TNF-的表達(dá)，經(jīng)IL-17預(yù)處理的肝細(xì)胞與枯否細(xì)胞共培養(yǎng)，TGF-β1和TNF-的表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低。 (9)小鼠肝細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)可以誘導(dǎo)-SMA、TGF-β1、MMP3、Collagen-1以及TIMP1的表達(dá)，，經(jīng)IL-17預(yù)處理的肝細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞共培養(yǎng)，-SMA、TGF-β1、MMP3、Collagen-1以及TIMP1的表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低。 【結(jié)論】在CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷的過(guò)程中，肝內(nèi)IL-17和肝細(xì)胞IL-17R的表達(dá)水平均顯著升高；IL-17可以通過(guò)上調(diào)Bcl-2，抑制Caspase-3活化而抑制自發(fā)性的和CCl4誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡；IL-17預(yù)處理可以降低肝細(xì)胞對(duì)枯否細(xì)胞以及肝星狀細(xì)胞的活化效應(yīng)；IL-17可能通過(guò)調(diào)控肝細(xì)胞凋亡參與肝臟損傷與修復(fù)。
【關(guān)鍵詞】：IL-17 肝纖維化 肝硬化 CCl4 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R575.2
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-14
• 文獻(xiàn)回顧14-24
• 1. 肝纖維化/肝硬化在我國(guó)發(fā)病率高、預(yù)后差、死亡率高，目前尚缺乏有效治療手段。因此，對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究至關(guān)重要14-15
• 2. 肝纖維化/肝硬化發(fā)病機(jī)制的研究現(xiàn)狀15-16
• 3. 在肝纖維化/肝硬化中，肝細(xì)胞凋亡是最常發(fā)生的變化。肝細(xì)胞凋亡與炎癥以及肝纖維化均密切相關(guān)16-18
• 4. IL-1718-24
• 第一部分 CCL4對(duì)小鼠肝內(nèi) IL-17 表達(dá)的影響24-31
• 1 材料和儀器24-25
• 2 方法25-28
• 3 結(jié)果28-30
• 4 討論30-31
• 第二部分 IL-17 對(duì)肝細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制31-54
• 1 材料和儀器31-34
• 2 方法34-41
• 3 結(jié)果41-51
• 4 討論51-54
• 第三部分 IL-17 在肝細(xì)胞活化枯否細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞中的作用54-68
• 1 材料和儀器54-57
• 2 方法57-61
• 3 結(jié)果61-66
• 4 討論66-68
• 小結(jié)68-69
• 參考文獻(xiàn)69-77
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果77-78
• 致謝78

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：349926