目的:產(chǎn)甲酸草酸桿菌（Oxalobacter fomigenes, Ox.F）是一種能降解草酸的腸道厭氧菌,其中降解草酸的關(guān)鍵酶是甲酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶（Formyl-CoA transferase, FCoAT）和草酰輔酶脫羧酶（Oxalyl-CoA Decarboxylase, OcoAD）。從中國人腸道產(chǎn)甲酸草酸桿菌Ox.F中克隆編碼FCoAT的FRC基因和OCoAD的OXC基因,并將FRC基因和OXC基因分別與過表達慢病毒載體重組,制備能表達FCoAT和FCoAT的慢病毒,為下一步轉(zhuǎn)染肝干細胞治療高草酸尿癥奠定基礎(chǔ)。方法:用細菌基因組提取試劑盒提取中國人Ox.F的基因組DNA作為模板,用Taq高保真DNA聚合酶分別擴增FRC基因和OXC基因片段,用DNA凝膠回收試劑盒切膠回收擴增片段,用DNA連接試劑盒將回收產(chǎn)物分別與pMD18-T Simple載體連接,分別獲得FRC基因和OXC基因的克隆載體,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,挑取陽性克隆并進行測序,篩選出攜帶完整目的基因的質(zhì)粒pMD18T simple- FRC和pMD18T simple-OXC,質(zhì)粒提取,用BamH I限制性... 

【文章來源】：華中科技大學湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：98 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

pMD18Tsimplevector示意圖

圖2 pLenti6.3/v5- DEST慢病毒載體示意圖接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取單克隆，質(zhì)粒小量提取并測毒載體包裝按照美國 Invitrogen 公司的 Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染手冊進行：狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的 HEK293T 細胞，用 0.25％胰酶消化培養(yǎng)瓶，得到細胞懸液并計數(shù)后，按照每個 10cm 培養(yǎng)皿 6×106個細胞數(shù)接種于入完全培養(yǎng)液 DMEM +10% FBS 在 37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜長狀態(tài)穩(wěn)定并達到細胞貼壁覆蓋率達到 80％以上才行轉(zhuǎn)染；二天轉(zhuǎn)染前移去培養(yǎng)液，用無血清 DMEM 細胞培養(yǎng)基清洗培養(yǎng)皿底細胞l Invitrogen Opti-MEM 減血清細胞培養(yǎng)基； 9μg Packaging Mix（Invitrogen）和 3μg 慢病毒表達質(zhì)粒加入經(jīng) 37℃預(yù)熱MEM 減血清細胞培養(yǎng)基中，輕輕混勻；

甲酸草酸桿菌的基因總 DNA 瓊脂糖凝膠-Hind Ⅲ DNA Marker，2.基因組 DNA試劑盒（Agarose Gel）切膠回收 FRC 和取 1μl 進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖 41 2 3

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3490369