本文關(guān)鍵詞：大黃素聯(lián)合KGF與HIF-1α在低氧細(xì)胞應(yīng)激損傷中的自噬機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:采用傳統(tǒng)中藥提取物結(jié)合基因治療的策略,用于保護(hù)低氧環(huán)境下?lián)p傷的腸粘膜,改善腸粘膜屏障的結(jié)構(gòu)和功能。本實(shí)驗(yàn)以大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞(IEC-6)為體外模型,使用大黃素聯(lián)合低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxiainducible factor-1α,HIF-1α)和角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(keratinocyte growth factor,KGF),建立新的治療方案,明確其在低氧所致腸應(yīng)激損傷中通過細(xì)胞自噬機(jī)制起保護(hù)作用。方法:1.通過MTT法篩選大黃素最佳作用濃度;2.用攜帶GFP熒光蛋白基因的腺病毒轉(zhuǎn)染IEC-6細(xì)胞,測(cè)定最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(multiplicityofy infection,MOI);3.分為四組:對(duì)照組,細(xì)胞因子組(攜帶雙基因HIF-1α和KGF組),大黃素組,大黃素聯(lián)合細(xì)胞因子組(攜帶雙基因HIF-1α和KGF聯(lián)合大黃素組),各組分別作用相應(yīng)藥物;4.在低氧0小時(shí)、6小時(shí)、24小時(shí)分別MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存率、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期;5.在低氧6小時(shí)、24小時(shí)分別行透射電鏡觀察自噬體的出現(xiàn)、Real time-PCR檢測(cè)自噬相關(guān)基因(Beclin-1、LC3)、Western-blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白(Beclin-1、LC3);6.攜帶HIF-1α和KGF兩種基因的腺病毒轉(zhuǎn)染IEC-6細(xì)胞,用Real time-PCR法、免疫熒光法、Western-blot蛋白印記法檢測(cè)細(xì)胞因子組和大黃素聯(lián)合細(xì)胞因子組在低氧0小時(shí)、6小時(shí)、24小時(shí)兩種外源基因(HIF-1α、KGF)的表達(dá)。結(jié)果:1.大黃素在濃度為5μmol/L時(shí)具有明顯促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)作用;2.根據(jù)攜帶GFP熒光蛋白基因的腺病毒轉(zhuǎn)染IEC-6檢測(cè)熒光表達(dá)率與相應(yīng)MTT實(shí)驗(yàn)可得到腺病毒的最佳MOI為100;攜帶HIF-1α和KGF的腺病毒按照最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)轉(zhuǎn)染IEC-6;3.MTT法可得出在低氧條件下,大黃素聯(lián)合細(xì)胞因子組對(duì)IEC-6細(xì)胞有較好的保護(hù)作用,細(xì)胞周期結(jié)果顯示細(xì)胞因子可明顯阻滯細(xì)胞在G1期(P0.01),大黃素可明顯促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入分裂期(P0.01),大黃素聯(lián)合細(xì)胞因子組可促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期(P0.01),因此,大黃素促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入分裂期作用大于細(xì)胞因子阻滯細(xì)胞作用,大黃素聯(lián)合細(xì)胞因子組有明顯的促細(xì)胞生長(zhǎng)作用。4.電鏡下可見低氧6小時(shí)、24小時(shí)各組細(xì)胞均可見自噬小體出現(xiàn);Real time-PCR檢測(cè)與常氧對(duì)照組相比,低氧6小時(shí)、24小時(shí)后自噬相關(guān)基因Beclin-1及LC3表達(dá)量均上調(diào)(P0.01),其中自噬相關(guān)基因Beclin-1、LC3在低氧6小時(shí)的表達(dá)較24小時(shí)基因表達(dá)明顯增多(P0.05),且大黃素聯(lián)合細(xì)胞因子組較大黃素組、細(xì)胞因子組及對(duì)照組組表達(dá)增多(P0.05);Western-blot結(jié)果提示低氧6、24小時(shí)后,Beclin-1與LC3蛋白均有表達(dá),大黃素聯(lián)合細(xì)胞因子組較大黃素組、細(xì)胞因子組及對(duì)照組表達(dá)增多(P0.05)。5.Real time-PCR法及免疫熒光法檢測(cè)HIF-1α及KGF兩種外源基因在低氧0、6、24小時(shí)在IEC-6細(xì)胞內(nèi)均穩(wěn)定表達(dá);Western-blot結(jié)果提示腺病毒攜帶的基因在轉(zhuǎn)入細(xì)胞后HIF-1α蛋白穩(wěn)定表達(dá),在常氧對(duì)照組及低氧各組表達(dá)中無明顯差異(P0.05)。結(jié)論:1.大黃素聯(lián)合細(xì)胞因子在低氧條件下,可通過增強(qiáng)細(xì)胞的自噬機(jī)制對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用。2.大黃素聯(lián)合細(xì)胞因子(HIF-1α和KGF)較單用大黃素或細(xì)胞因子促進(jìn)自噬相關(guān)基因的激活及蛋白的表達(dá)作用更為明顯。3.攜帶兩種基因的腺病毒可穩(wěn)定安全的將HIF-1α和KGF外源基因轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)部,并且在核酸水平及蛋白水平穩(wěn)定表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：自噬 大黃素 低氧誘導(dǎo)因子-1α 角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子 低氧 腸粘膜
【學(xué)位授予單位】：甘肅中醫(yī)藥大學(xué)(原名：甘肅中醫(yī)學(xué)院)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R57
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 中英文縮略詞表9-10
• 前言10-12
• 立題依據(jù)12-15
• 實(shí)驗(yàn)研究15-40
• 1. 材料15-17
• 1.1 主要儀器15
• 1.2 主要試劑與材料15-17
• 1.2.1 試劑與材料15-16
• 1.2.2 試劑配制方法16-17
• 2. 方法17-24
• 2.1 大黃素最佳濃度篩選17-18
• 2.2 腺病毒最佳感染MOI值篩選18
• 2.3 MTT法測(cè)細(xì)胞生存率18
• 2.4 流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞周期18-19
• 2.5 電鏡下觀察自噬體19
• 2.6 Real time-PCR測(cè)自噬相關(guān)基因Beclin-1、LC319-22
• 2.7 Western-blot測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC322-23
• 2.8 Real time-PCR測(cè)HIF-1α、KGF基因23
• 2.8.1 人HIF-1α、KGF基因設(shè)計(jì)如下：23
• 2.8.2 分別取常氧及低氧 6h、24h 的細(xì)胞因子組、大黃素聯(lián)合細(xì)胞因子組提取的 RNA，，按照 2.6.3 方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)23
• 2.9 免疫熒光法觀察HIF-1α、KGF蛋白表達(dá)23-24
• 2.10 Western-blot測(cè)HIF-1α蛋白24
• 2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析24
• 3. 結(jié)果24-37
• 3.1 大黃素最佳作用濃度篩選24-25
• 3.2 腺病毒最佳感染MOI值篩選25-28
• 3.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率28-29
• 3.4 細(xì)胞周期29-31
• 3.5 電鏡下觀察自噬體31-32
• 3.6 自噬相關(guān)基因的檢測(cè)32-34
• 3.7 自噬相關(guān)蛋白的檢測(cè)34-35
• 3.8 Real time-PCR檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染雙基因后HIF-1α及KGF在細(xì)胞中的基因表達(dá)3135-36
• 3.9 免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染雙基因后HIF-1α及KGF在細(xì)胞中的蛋白表達(dá).323.10 Western-blot檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染雙基因后HIF-1α在細(xì)胞中的蛋白表達(dá)36
• 3.10 Western-blot 檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染雙基因后 HIF-1α在細(xì)胞中的蛋白表達(dá)36-37
• 4.分析與討論37-40
• 結(jié)論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-46
• 綜述46-54
• 參考文獻(xiàn)51-54
• 攻讀碩士學(xué)位期間的研究工作與成果54-55
• 致謝55-56
• 附錄56-57

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前9條

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本文編號(hào)：345212