本文關鍵詞：非酒精性脂肪性肝病中Kupffer細胞激活方式的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景及目的： 近年來,隨著社會經(jīng)濟水平的提高,人們生活方式的改變,非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)已成為我國導致慢性肝病的重要原因之一。NAFLD包括一系列相互聯(lián)系的病理改變,從單純性脂肪肝(Nonalcoholic simple fatty liver, NAFL)、脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis, NASH),到肝纖維化、肝硬化,甚至可以進展為肝細胞癌。目前,NAFLD的發(fā)病機制尚不明確,隨著人們對巨噬細胞在機體免疫及脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)中的作用的了解不斷增加,關于Kupffer細胞(Kupffer cells, KCs)與NAFLD發(fā)病機制關系的研究逐漸升溫。KCs是定居于肝血竇的單核-巨噬細胞,能夠在竇實質(zhì)和脈管腔隙間遷移,在兩者間建立聯(lián)系。已有一些研究表明,在異常情況下,激活的KCs可通過產(chǎn)生多種生物活性介質(zhì)如細胞因子、趨化因子、蛋白水解酶、ROS和NO等在多種肝損傷中起重要作用。CD4+T細胞可分為Th1和Th2兩個亞群,Th1和Th2細胞分泌不同的細胞因子分別刺激KCs向兩個方向激活,故相應的KCs存在兩種表型,即M1型(經(jīng)典激活巨噬細胞),M2型(選擇性激活巨噬細胞)。M1型由促炎介質(zhì)激活如IFN-γ,能誘導一些細胞因子釋放(如IL-12, IL-6, TNF-α,IL-23)。M2型則被IL-4和IL-13等激活,參于組織的修復、組織纖維化和血管形成等。在NAFLD形成機制中,KCs在經(jīng)典激活和選擇性激活兩種狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換可能影響NFALD的發(fā)病,目前尚未見文獻做體內(nèi)研究的扳道。本研究旨在通過體內(nèi)實驗的方法,探索KCs在NAFLD早期的激活方式變化。 方法： (1)小鼠非酒精性脂肪性肝病模型構(gòu)建：將C57BL/6J雄性小鼠分為對照組和高脂模型組,分別飼養(yǎng)4周,8周,12周三個時間點,同時觀察每個階段小鼠的一般情況,檢測血清肝功能指標,并固定部分肝組織做病理切片,留取部分肝組織按TG測定試劑盒說明書步驟測定肝中TG含量。飼養(yǎng)環(huán)境明暗各12小時,實驗小鼠可自由進食和飲水,4只一籠飼養(yǎng)。 (2)小鼠肝臟原代KCs流式分選及評價：小鼠隔夜禁食麻醉后,采用膠原酶原位消化,肝離體后繼續(xù)消化,細胞懸液以差速離心去除肝實質(zhì)細胞(HC),非實質(zhì)細胞通過密度梯度離心獲得,KCs通過流式細胞儀,標記CD45-APC和F4/80-PE抗體進行分選純化,CD45+F4/80+即為KCs。 (3) KCs的培養(yǎng)及油紅O染色：用DMEM(H)培養(yǎng)基加10%胎牛血清加1%雙抗(鏈霉素+青霉素)培養(yǎng)KCs,24h后吸棄培養(yǎng)基,用PBS輕柔漂洗后加入4%多聚甲醛固定15min,然后用油紅稀釋液染色15min,60%異丙醇漂洗后用蘇木素復染5min,顯微鏡下觀察并拍照。 (4) qRT-PCR檢測：反應體系為：KCs的cDNA為模板,SYBR Green II為熒光染料,不同基因的引物(內(nèi)參基因和待測基因),MiX (DNA聚合酶,四種脫氧核苷酸,緩沖溶液,內(nèi)參染料),設置反應參數(shù)條件進行定量PCR,最后分析數(shù)據(jù)。 (5)流式分析對照組和模型組中KCs所占比列及表面標志物CD206：流式分析檢測管中加入F4/80-PE和CD206-FITC抗體進行檢測。 結(jié)果： (1)小鼠脂肪肝模型構(gòu)建：與對照組相比,造模4周病變輕微,8周呈以小泡性為主的混合性脂肪變性,造模12周,肝細胞脂肪變性程度較8周時明顯加重,肝細胞表現(xiàn)為大泡性脂肪變性,三個階段肝小葉及匯管區(qū)都無炎癥細胞浸潤、肝細胞壞死和纖維化等其他組織學表現(xiàn)。肝中TG的含量隨著造模時間延長也逐漸增加。 (2)流式細胞術分選KCs：細胞純度可達95%以上。 (3)油紅O染色：模型組細胞較對照組細胞變圓,核大,部分細胞核被擠到一側(cè),呈印戒樣改變,胞漿內(nèi)可見大量紅染的脂滴。 (4)KCs的M1型和M2型標志物檢測結(jié)果：M1型標志物TNF-α, IL-6,IL-12b水平顯著上調(diào),而M2型的標準物Arg-1, CD206水平顯著下調(diào),表明脂肪肝階段,M1型KCs占優(yōu)勢。 (5)流式結(jié)果分析：模型組較對照組KCs細胞比例未發(fā)生顯著變化,而M2型表面標志物CD206表達強度下降,與qRT-PCR結(jié)果相符。 結(jié)論： (1)單純性脂肪肝階段KCs并未通過增加數(shù)量發(fā)揮作用； (2)單純性脂肪肝階段KCs形態(tài)上發(fā)生變化：吞噬大量脂滴,呈現(xiàn)泡沫狀； (3)單純性脂肪肝階段雖然炎癥尚未發(fā)生,但KCs表型已呈現(xiàn)M1型優(yōu)勢,可能影響脂肪肝進一步發(fā)展。
【關鍵詞】：非酒精性脂肪性肝病 Kupffer細胞 流式細胞術 表型
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R575.5
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 插圖和附表清單12-13
• 縮略語表13-14
• 目次14-15
• 1 引言15-17
• 2 材料與方法17-25
• 2.1 實驗材料17-19
• 2.2 實驗方法19-25
• 3 結(jié)果25-35
• 3.1 小鼠非酒精性脂肪肝模型的構(gòu)建及評價25-28
• 3.2 小鼠肝臟原代KCs分選結(jié)果分析評價28-31
• 3.3 脂肪肝發(fā)生后KCs的形態(tài)改變31
• 3.4 qRT-PCR檢測KCs表型標志物31-33
• 3.5 流式細胞儀檢測KCs表面CD206表達情況33-35
• 4 討論35-40
• 5 結(jié)論40-41
• 參考文獻41-45
• 綜述45-54
• 參考文獻51-54
• 作者簡歷54

【共引文獻】

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本文編號：345016