目的 :研究間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell,MSC）移植后對(duì)肝纖維化及肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells,HSC）活化的抑制作用。方法:Ficoll-Hypaque梯度密度離心法及細(xì)胞貼壁培養(yǎng)法分離純化4周齡SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BM-MSC）。取18只SD大鼠,通過腹腔小劑量注射四氯化碳（CCl4）8周,進(jìn)行肝纖維化造模,在造模4周時(shí),取其中9只作為治療組,每周經(jīng)尾靜脈移植給予該組每只大鼠6×106個(gè)MSC;另外9只作為模型對(duì)照組,經(jīng)尾靜脈給予不含MSCs的等量生理鹽水;另取9只大鼠,作為正常對(duì)照組,僅給予尾靜脈等量生理鹽水注射,持續(xù)4周。自實(shí)驗(yàn)開始,每周用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、白蛋白（ALB）水平,至結(jié)束共測(cè)定8次。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)通過免疫組化對(duì)α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth facto... 

【文章來源】：南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2015,35(07)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

SD大鼠血清肝功能相關(guān)指標(biāo)測(cè)定－500－1000－5第1周第2周第3周第4周第5周第6周第7周第8周第1周第2周第3周第4周第5周第6周第7周第8周第

南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)第35卷第7期2015年7月左下角圖為炎性浸潤區(qū)域放大圖（×400）。圖2SD大鼠肝臟切片HE染色Figure2LiverslicesHEstaininginSDrats模型組治療組正常對(duì)照組2．3．2Masson染色Masson染色統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用Image-Proplus軟件進(jìn)行，結(jié)果顯示治療組總膠原含量明顯低于模型組，說明治療組纖維化程度較模型組輕（圖3）。2．3．2α-SMA、COLⅠ、TGF-β1免疫組織化學(xué)染色模型組大鼠肝臟切片鏡下顯示肝細(xì)胞排列紊亂，假小葉形成明顯，假小葉間纖維增生組織高表達(dá)COLⅠ，纖維組織內(nèi)側(cè)高表達(dá)TGF-β1，竇周高表達(dá)α-SMA。治療組肝索結(jié)構(gòu)趨于正常，纖維組織增生不明顯，纖維增生組織COLⅠ表達(dá)較模型組明顯減低，纖維組織內(nèi)側(cè)TGF-β1表達(dá)極少，較模型組明顯減低，竇周表達(dá)α-SMA較模型組明顯減少。正常對(duì)照組肝索結(jié)構(gòu)正常，呈放射狀排列，小葉結(jié)構(gòu)正常，小葉間無明顯纖維隔形成，無明顯COLⅠ表達(dá)，纖維組織內(nèi)側(cè)基本無TGF-β1表達(dá)，竇周基本不表達(dá)α-SMA（圖3）。2．4SD大鼠HSC提取及鑒定分離得到的HSC接種后立即置于326nm紫外光下受激發(fā)，細(xì)胞自發(fā)出極易淬滅的熒光；培養(yǎng)約7d后HSC活化，α-SMA免疫熒光染色呈陽性，經(jīng)上述兩種方法可鑒定提取的細(xì)胞為HSC（圖4）。2．5HSC中α-SMA、TGF-β1mRNA和蛋白表達(dá)qRT-PCR檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示：治療組α-SMA、TGF-β1、COLⅠmRNA的表達(dá)量明顯低于模型組（P＜0．01）；Westernblot結(jié)果顯示：治療組HSC細(xì)胞中α-SMA、TGF-β1的蛋白表達(dá)量明顯低于模型組（P＜0．01，圖5）。提示治療組經(jīng)尾靜脈MSC移植后，HSC中α-SMA、TGF-β1mRNA和蛋白的表達(dá)較模型組明顯減低，HSC活化程度受抑制。3討論MSC作為基質(zhì)干細(xì)胞的一種擁有自我復(fù)制和多分化的潛能，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎癥反應(yīng)和外分泌營養(yǎng)功能

**P＜0．01；與治療組比較，＃P＜0．05，＃＃P＜0．01（n＝4）；B：HSC中α-SMA、TGF-β1的蛋白表達(dá)量，GAPDH作為內(nèi)參（8周）；C：用ImageJ軟件對(duì)Westernblot結(jié)果作灰度量化分析，每指標(biāo)重復(fù)3次取均值。與模型組比較，**P＜0．01；與治療組比較，＃＃P＜0．01（n＝3）。圖5SD大鼠HSC中α-SMA、TGF-β1mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化Figure5α-SMA，TGF-β1mRNAandproteinexpressionchangesofHSCinSDratsABCA：HSC培養(yǎng)7d（×100）；B：HSC接種后326nm紫外光激發(fā)（×100）；C：HSC活化后高表達(dá)α-SMA（×400）。圖4SD大鼠HSC培養(yǎng)及鑒定Figure4IdentificationandmorphologyofHSCculturedinvitroABC—α-SMA—GAPDH—TGF-β1—GAPDH正常對(duì)照組治療組模型組6543210mRNA相對(duì)倍數(shù)α-SMATGF-β1****＃＃****＃蛋白相對(duì)倍數(shù)3．02．52．01．51．00．50α-SMATGF-β1**＃＃**＃＃****高表達(dá)α-SMA與其自身獲得收縮能力有關(guān)［17］。TGF-β1被認(rèn)為是加速肝纖維化形成的主要細(xì)胞因子，在正常肝臟中表達(dá)較低，HSC在肝纖維化過程中被激活后開始大量表達(dá)TGF-β1并通過TGF-β／Smad信號(hào)通路反作用于自身，促其膠原基因表達(dá)、加速膠原的分泌和沉積［18］。在本實(shí)驗(yàn)組織病理研究中發(fā)現(xiàn)治療組肝組織纖維化程度及α-SMA、TGF-β1、COLⅠ表達(dá)水平均明顯降低，與Tanimoto等［19］用人MSC培養(yǎng)后治療免疫缺陷小鼠肝纖維化研究結(jié)果類似。因此，推測(cè)此結(jié)果可能與MSC移植后HSC活化程度減低有關(guān)。接下來我們直接提取HSC進(jìn)行RNA和蛋白表達(dá)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示治療組HSC中α-SMA、TGF-β1mRNA和蛋白的表達(dá)水平皆低于模型組，表明

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌物質(zhì)誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡的體外研究[J]. 徐喨,施啟鵬,周晗,蔡潔,李軍,章莉莉.  南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2014(08)



本文編號(hào)：3440700