本文關(guān)鍵詞：調(diào)控Nrf2表達(dá)對肝細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞抗氧化能力的影響及機(jī)制初步探討，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)以其高發(fā)率及危害性得到了廣泛關(guān)注,直到現(xiàn)在,其發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。眾多研究顯示遺傳易感性和胰島素抵抗可能與NASH的發(fā)生與發(fā)展關(guān)系緊密。NASH的一個(gè)很重要的危害就是其向肝纖維化發(fā)展的不可逆性,肝臟纖維化是由于細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)合成過多,同時(shí)未能及時(shí)降解導(dǎo)致其積聚,從而影響正常的肝臟結(jié)構(gòu)和功能。ECM是由肝星狀細(xì)胞(hepatic satellite cell,HSC)合成分泌的,當(dāng)各種刺激誘導(dǎo)HSC使其活化為肌成纖維細(xì)胞,產(chǎn)生大量的ECM,成為肝臟纖維化的基礎(chǔ),HSC是研究NASH進(jìn)展至關(guān)重要的靶細(xì)細(xì)。研究發(fā)現(xiàn)NASH患者肝組織標(biāo)本肝細(xì)胞凋亡明顯增多,并且隨肝纖維化和肝炎炎癥病變程度的增加而增加,因此,肝細(xì)胞的凋亡與NASH關(guān)系密切。核轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)作為細(xì)胞防御氧化應(yīng)激的重要調(diào)節(jié)因子,主要是通過抵御內(nèi)、外源性的氧化應(yīng)激來保護(hù)細(xì)胞。Nrf2在NASH中的保護(hù)作用明確,但具體機(jī)制尚未完全闡明。p66Shc在細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡過程中發(fā)揮重要作用。研究顯示,敲除p66Shc可增強(qiáng)小鼠的抗氧化能力,且延長其壽命。p66Shc在心臟、肝臟、脾臟、肺臟中表達(dá)程度不同,在動(dòng)物脂肪組織中表達(dá)較高,可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積和脂肪組織的形成有關(guān)。脂質(zhì)過氧化引起的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致NASH纖維化的重要因素,抗氧化治療有助于延緩肝內(nèi)炎癥及纖維化的發(fā)展。IQGAP1是一種Ras GTP酶活化蛋白,在細(xì)胞骨架形成和粘附中起重要作用。最新研究顯示IQGAP1可能是Nrf2的伴侶分子,在保持Nrf2的穩(wěn)定性過程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)上調(diào)IQGAP1表達(dá)會增加Nrf2的抗氧化效應(yīng),提高抗氧化基因的表達(dá),下調(diào)IQGAP1的表達(dá)則可降低Nrf2的穩(wěn)定性和II相酶的表達(dá),導(dǎo)致抗氧化能力的減弱。目的我們在前期研究證實(shí)Nrf2在NASH的進(jìn)展中起保護(hù)作用的基礎(chǔ)上,采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù),構(gòu)建上調(diào)和下調(diào)Nrf2的穩(wěn)轉(zhuǎn)大鼠肝星狀細(xì)胞株和肝細(xì)胞株,應(yīng)用葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GO)構(gòu)建細(xì)胞氧化應(yīng)激模型,觀察調(diào)控Nrf2表達(dá)對兩種細(xì)胞抗氧化能力的影響,并進(jìn)一步探討調(diào)控Nrf2表達(dá)對p66Shc和IQGAP1蛋白表達(dá)的影響,為完善Nrf2在NASH中的保護(hù)機(jī)制及治療該病提供新的研究方向。方法1.針對大鼠Nrf2基因4個(gè)干擾位點(diǎn),設(shè)計(jì)并構(gòu)建4種Nrf2基因sh RNA慢病毒重組質(zhì)粒載體;利用PCR技術(shù)從含有rat Nrf2的質(zhì)粒模板中克隆目的基因,構(gòu)建含Nrf2的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒載體。進(jìn)行慢病毒載體的包裝、測序鑒定及滴度測定,分別轉(zhuǎn)染大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6和肝細(xì)胞株BRL-3A細(xì)胞,用real time PCR(RT-PCR)和Western blot技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染96h后的細(xì)胞的Nrf2表達(dá)水平,確定轉(zhuǎn)染成功后,用致死量濃度藥物嘌呤霉素(2.5ug/ml)處理細(xì)胞,篩選并構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。2.將穩(wěn)轉(zhuǎn)的HSC-T6和BRL-3A分為對照組和氧化應(yīng)激組,每個(gè)組含5個(gè)亞組,以HSC-T6為例,分別為HSC-T6(空白對照組)、HSC-T6-sh RNA-NC(下調(diào)Nrf2陰性對照組)、HSC-T6-sh RNA(下調(diào)Nrf2組)、HSC-T6-Nrf2-NC(上調(diào)Nrf2陰性對照組)和HSC-T6-Nrf2(上調(diào)Nrf2組)。對照組常規(guī)培養(yǎng);氧化應(yīng)激組:加入含100U/L GO的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)2h,制備氧化應(yīng)激模型。流式細(xì)胞儀檢測活性氧(Reactive oxygen species,ROS)含量,用酶標(biāo)儀來檢測細(xì)胞生存率及丙二醛(malondialdehyde,MDA)、乳酸脫氫酶(Lactic Acid Dehydrogenase,LDH)、超氧化物歧化酶(super-oxide dismutase,SOD)的表達(dá)水平。3.分別提取實(shí)驗(yàn)2中對照組和氧化應(yīng)激組的細(xì)胞總蛋白,Western blot檢測p66Shc和IQGAP1蛋白表達(dá)情況。結(jié)果1.測序證實(shí)Nrf2的sh RNA及表達(dá)質(zhì)粒的成功構(gòu)建。HSC-T6和BRL-3A轉(zhuǎn)染重組慢病毒載體后常規(guī)培養(yǎng)96 h,RT-PCR和Western blot證實(shí)重組慢病毒載體能在m RNA和蛋白水平有效下調(diào)/上調(diào)靶細(xì)胞中Nrf2基因的表達(dá)。用致死量濃度藥物嘌呤霉素處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,再次RT-PCR和Western blot證實(shí)Nrf2基因的表達(dá)在m RNA和蛋白水平均被抑制/促進(jìn)。我們成功構(gòu)建下調(diào)/上調(diào)Nrf2表達(dá)的穩(wěn)定表達(dá)HSC-T6和BRL-3A細(xì)胞株。2.對于HSC-T6,對照組各指標(biāo)(ROS、MDA、LDH、生存率和SOD)無顯著性差異(P0.05);而氧化應(yīng)激刺激組ROS、MDA、LDH水平較對照組顯著升高(P0.05),生存率和SOD水平降低(P0.05)。在氧化應(yīng)激組中,上調(diào)Nrf2組的ROS、MDA、LDH水平較空白及其各自陰性對照組均下降(P0.05),生存率和SOD水平升高(P0.05);下調(diào)Nrf2亞組則得到相反的結(jié)果(P0.05)。在BRL-3A中也得到相同結(jié)論。3.對于HSC-T6,上調(diào)Nrf2組后,較空白及其各自陰性對照組,p66Shc蛋白表達(dá)水平下降(P0.05),IQGAP1蛋白表達(dá)水平升高(P0.05);下調(diào)Nrf2組結(jié)果相反(P0.05)。氧化應(yīng)激組中,與對照組比較,p66Shc和IQGAP1蛋白表達(dá)量均升高,上調(diào)Nrf2組。較空白及其各自陰性對照組,p66Shc表達(dá)水平顯著下降(P0.05),IQGAP1表達(dá)水平顯著升高(P0.05);下調(diào)Nrf2組結(jié)果相反(P0.05)。在BRL-3A中也得到相同結(jié)論。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建Nrf2基因沉默和過表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)HSC-T6和BRL-3A細(xì)胞株。Nrf2在兩種細(xì)胞株中都具有抗氧化應(yīng)激作用,且這種保護(hù)作用可能與p66Shc和IQGAP1的表達(dá)密切相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：NASH Nrf2 氧化應(yīng)激 短發(fā)夾狀RNA 慢病毒載體 HSC-T6 p66Shc IQGAP1
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R575.1
【目錄】：

• 縮略語表5-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-17
• 文獻(xiàn)回顧17-29
• 實(shí)驗(yàn)一 調(diào)控Nrf2基因表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)大鼠肝細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞的構(gòu)建及鑒定29-49
• 引言29
• 1 實(shí)驗(yàn)材料29-32
• 2 實(shí)驗(yàn)方法32-38
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-46
• 4 實(shí)驗(yàn)討論46-49
• 實(shí)驗(yàn)二 調(diào)控Nrf2表達(dá)對肝細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞抗氧化應(yīng)激損傷能力的影響49-57
• 引言49
• 1 實(shí)驗(yàn)材料49-50
• 2 實(shí)驗(yàn)方法50-52
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-55
• 4 實(shí)驗(yàn)討論55-57
• 實(shí)驗(yàn)三 調(diào)控Nrf2表達(dá)對肝細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞p66Shc和IQGAP1表達(dá)的影響57-66
• 引言57
• 1 實(shí)驗(yàn)材料57-59
• 2 實(shí)驗(yàn)方法59
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果59-62
• 4 實(shí)驗(yàn)討論62-66
• 小結(jié)66-67
• 參考文獻(xiàn)67-77
• 附錄77-82
• 個(gè)人簡歷和研究成果82-83
• 致謝83

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 王泰齡,劉霞,周元平,何靜雯,張晶,李寧章,段鐘平,王寶恩;慢性肝炎炎癥活動(dòng)度及纖維化程度計(jì)分方案[J];中華肝臟病雜志;1998年04期

2 Mohammed A Alzoghaibi;;Concepts of oxidative stress and antioxidant defense in Crohn's disease[J];World Journal of Gastroenterology;2013年39期

  本文關(guān)鍵詞：調(diào)控Nrf2表達(dá)對肝細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞抗氧化能力的影響及機(jī)制初步探討，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：341538