本文關鍵詞：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激對巨噬細胞腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL）表達的調(diào)控及其分子機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：TRAIL(TNF-related apoptosis inducing-ligand)是繼TNF、Fas L之后發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死家族中第三個凋亡分子,其與細胞膜上的TRAIL受體DR4/5結(jié)合從而發(fā)揮生物學作用。在免疫系統(tǒng)中,免疫細胞的凋亡是重要的免疫調(diào)節(jié),是機體維持自身的穩(wěn)定,避免自身免疫疾病的重要機制。很多研究報道,TRAIL在自然殺傷(NK)細胞、中性粒細胞、T淋巴細胞,單核巨噬細胞和樹突狀細胞(DC)中表達,參與其對機體的免疫監(jiān)視,可能在促進免疫細胞凋亡,調(diào)節(jié)免疫耐受等方面有重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum,ER)是細胞蛋白質(zhì)的合成和運輸?shù)闹匾{(diào)節(jié)器。對種種刺激相當敏銳,蛋白質(zhì)折疊的需求增強或外界刺激等因素,均可引起ER蛋白折疊負荷和蛋白質(zhì)折疊能力之間的不平衡,導致錯誤折疊蛋白或未折疊蛋白在ER腔內(nèi)蓄積,從而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。前期研究發(fā)現(xiàn)在肝纖維化的恢復過程中,肝臟巨噬細胞可通過表達TRAIL促進肝星狀細胞的凋亡從而促進肝纖維化的恢復;ERS相關蛋白在肝纖維化病程中動態(tài)變化,ERS參與活化HSC凋亡的調(diào)控,其機制可能與其釋放細胞內(nèi)鈣離子,導致細胞內(nèi)鈣離子升高,從而誘導Calpain/Caspase和JNK/p38 MAPK激活有關。TRAIL可能通過誘導活化HSC中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白CHOP,GRP78,Caspase-12的表達,從而促進HSC的凋亡。ERS在肝纖維化的發(fā)病機制中可能起重要作用,然而ERS是否參與巨噬細胞TRAIL表達的調(diào)控,從而促進HSC凋亡,逆轉(zhuǎn)肝纖維化尚未有研究。本課題以三種不同來源的巨噬細胞為研究對象,旨在探討ERS對巨噬細胞TRAIL表達的調(diào)控及機制,從而進一步完善肝纖維化發(fā)病及逆轉(zhuǎn)機制的研究。主要研究內(nèi)容如下:1.ERS促進巨噬細胞表達TRAIL為了研究ERS對巨噬細胞中TRAIL表達的影響,分別給予給予不同的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導劑毒胡蘿卜素(Thapsigargin,TG)和衣霉素(tunicamycin,TM),體外誘導小鼠RAW264.7巨噬細胞株,THP-1細胞及原代小鼠腹腔巨噬細胞,采用RT-PCR法檢測TRAIL的m RNA表達變化;免疫印跡觀察細胞內(nèi)TRAIL總蛋白的表達變化;ELISA方法檢測可溶性TRAIL蛋白(s TRAIL)的表達變化;流式細胞儀檢測ERS對膜結(jié)合型TRAIL蛋白表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的兩種誘導劑均上調(diào)TRAIL m RNA水平表達和可溶性及總蛋白的表達,而對膜型TRAIL蛋白沒有顯著影響,提示ERS可能參與調(diào)控巨噬細胞TRAIL的表達。2.MAPK通路參與ERS誘導的巨噬細胞TRAIL的表達以RAW264.7細胞為研究對象,分別用1μM TG和1μg/ml TM刺激細胞0-24h,采用Western blot法檢測MAPK各下游通路是否激活。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,ERS能顯著誘導ERK,JNK和p38 MAPK蛋白的表達及激活,引起了細胞活化。再分別給予ERK抑制劑PD98059,JNK抑制劑SP600125及p38 MAPK抑制劑SB202190處理,采用RT-PCR方法檢測TRAIL m RNA水平;Western blot方法檢測TRAIL和ERK、JNK、p38 MAPK蛋白及磷酸化的程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與TG和TM模型組相比,JNK抑制劑SP600125同時顯著下調(diào)了TRAIL m RNA及蛋白水平。提示JNK MAPK通路可能參與ERS誘導的巨噬細胞TRAIL的表達。為了進一步探討JNK MAPK通路參與TRAIL表達的調(diào)控機制,分別用1μM TG和1μg/ml TM刺激細胞24h后,使用ELISA法,RT-q PCR法,Western blot法及雙熒光素酶報告基因法檢測JNK MAPK的下游轉(zhuǎn)錄因子AP-1(activator protein-1)的激活。結(jié)果顯示,ERS可使AP-1磷酸化及激活。進一步給予AP-1抑制劑SR 1130及轉(zhuǎn)染野生型TRAIL啟動子熒光素酶,采用RT-PCR法,RT-q PCR法,Western Blot,ELISA,熒光素酶報告基因?qū)嶒灧謩e檢測TRAIL m RNA,蛋白水平及熒光強度。結(jié)果顯示與TG,TM模型組相比,抑制AP-1通路明顯抑制TRAIL的表達。提示ERS誘導的活化巨噬細胞表達TRAIL的表達可能與JNK MAPK及AP-1信號通路有關。3.SOCS3負性調(diào)控巨噬細胞ERS誘導的TRAIL的表達為了觀察SOCS3對ERS誘導TRAIL的表達的影響,分別根據(jù)SOCS3的核苷酸序列序列設計并合成小干擾RNA(small interfering RNA,si RNA)及構(gòu)建好的p CMV-SOCS3質(zhì)粒,通過脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染到RAW264.7細胞內(nèi),熒光倒置顯微鏡觀察細胞的轉(zhuǎn)染效率;RT-PCR檢測SOCS3,TRAIL m RNA的水平;Western Blot法檢測SOCS3,TRAIL蛋白的水平;ELISA方法檢測可溶性TRAIL蛋白的表達變化。實驗結(jié)果表明,過表達SOCS3可以明顯降低ERS誘導的TRAIL的表達上調(diào)作用,而沉默的SOCS3可增強ERS誘導的巨噬細胞TRAIL的表達。4.SOCS3通過JNK/AP-1通路負性調(diào)節(jié)ERS誘導的TRAIL的表達RT-q PCR及Western blot法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),分別與TG和TM模型組相比,過表達SOCS3組可明顯降低模型組引起的AP-1各組分(c-Jun,c-Fos和Jun B)m RNA及磷酸化蛋白表達的上調(diào),而si RNA沉默SOCS3的表達增強模型組引起的AP-1 m RNA及蛋白的上調(diào)作用。進一步給予JNK抑制劑SP600125及AP-1抑制劑SR 1130,Western blot檢測結(jié)果顯示,給予JNK抑制劑SP600125及AP-1抑制劑SR 1130可明顯降低TRAIL蛋白的水平。以上結(jié)果進一步表明SOCS3可通過JNK/AP-1通路對ERS誘導的巨噬細胞株TRAIL表達負調(diào)控。
【關鍵詞】：肝纖維化 巨噬細胞 ERS TRAIL SOCS3
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R575.2

  本文關鍵詞：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激對巨噬細胞腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL）表達的調(diào)控及其分子機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：340748