研究背景及目的肝纖維化是肝臟對不同病因所致的慢性損傷共有的過修復(fù)反應(yīng),其病理特征是肝臟細胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）過度沉積及分布異常。肝星狀細胞（hepaticstellate cell,HSC）是纖維化肝臟中產(chǎn)生ECM的最主要細胞,HSC的活化是肝纖維化發(fā)生的核心環(huán)節(jié),設(shè)法抑制HSC激活、增殖與遷移是肝纖維化治療的重要對策。血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor,PDGF）是最強的促進HSC增殖的細胞因子,由A、B、C、D四條高度同源的多肽鏈組成,其中A、B亞基互相組合可以表現(xiàn)為AA、BB、AB三種分子形式。PDGF受體（platelet-derived growthfactor receptor,PDGFR）由兩種亞單位α及β構(gòu)成,靜止的HSC表面只有α亞單位,HSC活化后才表達β亞單位,而且以β亞單位為主,與PDGF-BB具有較強的親和力。PDGF-BB以及PDGFR-β在肝纖維化過程中發(fā)揮重要作用,設(shè)法抑制PDGF及其受體表達,阻斷PDGF細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是抗肝纖維化的治療策略之一。RNA干擾（RNA i... 

【文章來源】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)上海市 211工程院校

【文章頁數(shù)】：97 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

siRNA對HscPDGFR一pmRNA和蛋白表達水平的影響

圖1.3:siRNA對HSc增殖的影響圖A為BrdU摻入結(jié)合細胞免疫熒光染色檢測細胞增殖，其中藍色熒光顯示用DAPI標(biāo)記細胞核以方便細胞計數(shù)，綠色熒光顯示摻入BrdU的細胞的細胞核。圖B為BrdU摻入結(jié)合流式細胞技術(shù)檢測細胞增值，方框中顯示的數(shù)字即為摻入BrdU的細胞占細胞總數(shù)的百分比。圖C為A和B的統(tǒng)計圖，二FAc，代表流式細胞計數(shù)，二lF’’代表細胞免疫熒光染色，“**”表示p<0.01。圖D顯示westemBlot檢測對HSC進行不同處理對細胞內(nèi)信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)磷酸化的影響，‘·p098059’’是ERK的特異性抑制劑，作為陽性對照，、沖E既”指磷酸化的E既。圖E是用RT-PcR檢測不同處理對細胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子c一fos基因表達的影響。BrdU摻入試驗(無論是用細胞免疫熒光染色還是流式細胞術(shù)檢測)顯示HSC一T6

的小干擾RNA可以抑制HSC的增殖(圖1.3A，B，C)。由于MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是PDGF傳遞細胞增殖信號的主要途徑，我們檢測了HSC內(nèi)MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的兩個關(guān)鍵分子ERK和c一fos的表達。WestemBlot結(jié)果顯示PDGF一BB刺激可以使Hse的ERK蛋白磷酸化水平提高約1.3倍咖<0.05)，轉(zhuǎn)染siRNAcon對pDGF一BB的這種效應(yīng)無明顯影響(p>0.05)，而轉(zhuǎn)染s識到A95:則可以使經(jīng)PDGF一BB刺激的Hsc的ERK蛋白磷酸化水平降低約50%(p<0.05)。我們也發(fā)現(xiàn)PD98059可以使經(jīng)PDGF一BB刺激的Hsc的ERK蛋白磷酸化水平降低約65%(p<0.01)(圖1.3D)。RT-PCR檢測顯示PDGF一BB能明顯提高。一fos的表達水平，且這種效應(yīng)不受siRNAcon的影響，而轉(zhuǎn)染siRNA95:后。fos的表達水平受到明顯抑制(圖1.3E)。ERK蛋白磷酸化是MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要中間過程，而MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路正是通過促進核轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄促進細胞增殖的，說明阻斷細胞內(nèi)MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是siRNA957抑制PDGF一BB的促增殖效應(yīng)的主要機制之一。四、針對PDGFR一p的小干擾RNA對HsC的凋亡無明顯影響

【參考文獻】：
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本文編號：3268032